Vaccinia E5 est un inhibiteur majeur du capteur d'ADN cGAS

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 2898 (2023) Citer cet article

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Le capteur d'ADN GMP-AMP synthase cyclique (cGAS) est essentiel dans l'immunité antivirale de l'hôte. Le virus de la vaccine (VACV) est un grand virus à ADN cytoplasmique appartenant à la famille des poxvirus. La façon dont le virus de la vaccine antagonise la voie de détection de l'ADN cytosolique médiée par le cGAS n'est pas bien comprise. Dans cette étude, nous avons criblé 80 gènes de la vaccine pour identifier les inhibiteurs viraux potentiels de la voie du gène cGAS/stimulateur de l'interféron (STING). Nous avons découvert que la vaccine E5 est un facteur de virulence et un inhibiteur majeur du cGAS. E5 est responsable de l'abolition de la production de cGAMP lors de l'infection par le virus de la vaccine (souche Western Reserve) des cellules dendritiques. E5 se localise dans le cytoplasme et le noyau des cellules infectées. L'E5 cytosolique déclenche l'ubiquitination du cGAS et la dégradation dépendante du protéasome via l'interaction avec le cGAS. La suppression du gène E5R du génome du virus de la vaccine modifié Ankara (MVA) induit fortement la production d'IFN de type I par les cellules dendritiques (DC) et favorise la maturation des DC, et améliore ainsi les réponses des lymphocytes T spécifiques de l'antigène.

La GMP-AMP synthase cyclique (cGAS) est un capteur d'ADN majeur essentiel à l'immunité innée antivirale et antitumorale, ainsi qu'aux maladies inflammatoires auto-immunes1,2,3,4. Une fois activé par l'ADN cytosolique, cGAS génère du GMP-AMP cyclique (cGAMP), qui à son tour se lie à une protéine STING localisée dans le réticulum endoplasmique, entraînant l'activation de la voie TBK1/IRF3/IFNB. Par conséquent, les virus ont évolué pour employer de nombreuses stratégies pour échapper à cette importante voie antivirale5,6,7,8.

Les poxvirus sont de grands virus à ADN cytoplasmique qui sont d'importants agents pathogènes humains et vétérinaires, ainsi que des agents oncolytiques et des vecteurs viraux9,10,11. Le virus de la vaccine (VACV) a été utilisé avec succès comme vaccin pour l'éradication de la variole. Cependant, l'infection directe des cellules dendritiques (CD) par la vaccine entraîne l'inhibition des réponses immunitaires innées et adaptatives12,13,14. Le virus de la vaccine modifié Ankara (MVA) est une souche de la vaccine hautement atténuée avec suppression de grands fragments de son génome parental de la vaccine après plus de 570 passages en série dans des fibroblastes d'embryons de poulet, le rendant non réplicatif dans la plupart des cellules de mammifères15,16. Le MVA est un vecteur vaccinal important et a été récemment approuvé comme vaccin de deuxième génération contre la variole et le monkeypox10,17.

cGAS est important pour la défense de l'hôte contre l'infection à poxvirus. Les souris déficientes en cGAS sont plus sensibles à l'infection intranasale par le VACV2 et à l'inoculation du coussinet plantaire avec le virus de l'ectromélie, un poxvirus spécifique à la souris18. On a récemment découvert que le gène B2R de la vaccine code pour une nucléase cGAMP cytosolique (rebaptisée poxine), et la suppression de B2R du VACV a entraîné une atténuation du modèle de scarification cutanée (SS)19. Cependant, on ne sait pas si les poxvirus codent pour un ou plusieurs inhibiteurs directs de cGAS.

Dans cette étude, nous avons effectué un criblage de 80 gènes viraux de la vaccine pour l'inhibition de la voie cGAS/STING à l'aide d'un test de rapporteur à double luciférase et identifié plusieurs gènes de la vaccine codant pour des protéines impliquées dans la régulation négative de la voie cGAS/STING/IFNB. Ici, nous montrons que E5 (codée par le gène E5R), une protéine contenant le domaine BEN conservée parmi les orthopoxvirus20, est un facteur de virulence et un inhibiteur majeur de cGAS. E5 interagit avec le cGAS cytoplasmique et déclenche sa dégradation de manière dépendante du protéasome.

Le virus de la vaccine est un grand virus à ADN cytoplasmique avec un génome de 190 paires de kilobases (kbp) qui code pour plus de 200 protéines21,22. Le MVA a une délétion d'environ 30 kpb de son génome parental de la vaccine, entraînant la perte de nombreux gènes viraux immunomodulateurs15. L'infection par le MVA des BMDC a induit la sécrétion d'IFN-β et la production de cGAMP, alors que l'infection par la souche de vaccine de type sauvage WR (WT VACV) n'a pas réussi à le faire (Fig. 1a, b). Ces résultats suggèrent que WT VACV pourrait coder un ou plusieurs inhibiteurs viraux pour bloquer l'activation de cGAS et la production d'IFN-β en aval.

une analyse ELISA des niveaux d'IFN-β dans les surnageants de BMDC infectés par WT VACV ou MVA à un MOI de 10 pendant 16 h. Les lysats cellulaires ont été analysés par immunoblot. n = 3 échantillons indépendants. b Niveaux de cGAMP dans les BMDC infectés par WT VACV ou MVA à un MOI de 10. Les cellules ont été récoltées 2 et 8 h après l'infection. Les niveaux de cGAMP ont été mesurés par LC-MS. c Immunoblot de cGAS, C7 et E3 dans des BMDC de souris WT ou cGas−/− infectées par différents virus de la vaccine à MOI de 10 pendant 16 h. d Analyse ELISA des niveaux d'IFN-β dans les BMDC de souris WT ou cGas−/− infectées par différents virus de la vaccine à MOI de 10 pendant 16 h. n = 3 échantillons indépendants. e Analyse ELISA des niveaux de cGAMP dans les BMDC WT infectés par WT VACV ou VACVΔE5R à MOI de 10 pendant 16 h. n = 3 échantillons indépendants. Le test t de Student non apparié à deux queues a été utilisé pour les comparaisons de deux groupes dans les études. Les données sont représentatives de deux expériences indépendantes et présentées sous forme de moyenne ± SEM. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour identifier les inhibiteurs potentiels de cGAS du génome de la vaccine, nous avons d'abord sélectionné 80 gènes viraux, qui incluent principalement ceux exprimés au début de l'infection par la vaccine21, avec le raisonnement que les antagonistes de l'immunité innée sont probablement codés par les gènes viraux précoces. Un test à double luciférase a ensuite été effectué pour dépister les capacités de ces protéines virales à inhiber la voie de détection de l'ADN cytosolique médiée par cGAS/STING. Des stratégies similaires ont été utilisées avec succès pour dépister les inhibiteurs de cette voie par d'autres virus à ADN, comme indiqué précédemment5,23. Dans notre système, la transfection de cellules T HEK293 avec 10 ng de STING avait un effet d'induction limité du promoteur IFNB, tandis que la transfection avec 25 ng de STING améliorait le signal IFNB-luciférase de la luciole, suggérant qu'une quantité élevée de STING seul sans cGAS pourrait produire un signal de luciférase (Fig. 1a supplémentaire). Par conséquent, nous avons utilisé la co-transfection de STING (10 ng) et de cGAS (50 ng) dans notre crible dans le but de sélectionner des inhibiteurs potentiels de cGAS (Fig. 1b, c supplémentaires). L'adénovirus E1A code pour un inhibiteur connu de STING6, et notre groupe a récemment rapporté que le gène C7L de la vaccine code pour un inhibiteur de la voie IRF3/IFNB en empêchant la phosphorylation d'IRF324. Ici, nous avons montré que la co-transfection de E1A ou C7L avec STING (10 ng) et cGAS (50 ng) entraînait l'inhibition du signal IFNB-luciférase de luciole (Fig. 1b supplémentaire). Par conséquent, ils ont été sélectionnés comme témoins positifs pour le dépistage. Pour le criblage réel, les cellules HEK293T ont été transfectées avec des plasmides exprimant un rapporteur IFNB-luciférase de luciole, un plasmide témoin pRL-TK exprimant la luciférase de Renilla, cGAS (50 ng), STING (10 ng) et des gènes viraux individuels de la vaccine comme indiqué, ainsi que E1A et C7R (Fig. 1c supplémentaire). Ce test a identifié plusieurs gènes précoces du virus de la vaccine (E5R, K7R, B14R, C11R, WR199/B18R, WR200/B19R, E4L) comme inhibiteurs potentiels de la voie cGAS/STING (Fig. 1c, d supplémentaires). Pour tester si l'un des inhibiteurs candidats atténue l'activation du promoteur IFNB médiée par STING, nous avons co-transfecté des gènes candidats individuels avec STING à une quantité plus élevée (50 ng), ce qui provoque l'induction du promoteur IFNB sans cGAS. Nous avons constaté que la surexpression de tous les candidats, à l'exception de B14R, avait peu d'effet sur l'activité du promoteur IFNB induite par STING (50 ng), ce qui suggère que B14 pourrait cibler STING ou ses voies de signalisation en aval, tandis que d'autres candidats pourraient cibler cGAS (Fig. 1e supplémentaire). Parmi ces gènes, WR200/B19R est connu pour coder une protéine de liaison à l'IFN de type I25. Bien que K7, B14 et C11 aient été décrits comme des facteurs de virulence de la vaccine26,27,28 et que WR199/B18R code pour un facteur de gamme d'hôtes29,30, la façon dont ils échappent à la voie de l'IFN de type I n'est pas claire. E4L code pour la sous-unité RPO30 de l'ARN polymérase de la vaccine et un facteur de transcription intermédiaire31,32. Bien qu'il ait été rapporté que E5 était une protéine virale précoce associée aux virosomes (usines virales)33, on ne sait pas si elle joue ou non un rôle dans l'évasion immunitaire.

Nous avons émis l'hypothèse que la suppression d'un inhibiteur majeur de la voie cGAS/STING du génome du VACV entraînerait une induction plus élevée de l'IFN de type I que les autres mutants de délétion ou le virus parental. Pour tester cette idée, nous avons généré une série de virus VACV recombinants avec des délétions d'inhibiteurs viraux candidats individuels, notamment VACV∆E5R, VACV∆B2R, VACV∆E3L, VACV∆C11R, VACV∆WR199, VACV∆WR200, VACV∆K7R et VACV∆C7L. Les BMDC WT et cGAS-/- ont été infectés par WT VACV et les mutants de délétion. L'expression des protéines virales C7 et E3 a été déterminée pour vérifier l'infection virale (Fig. 1c). Les concentrations d'IFN-β dans les surnageants des BMDC infectés ont été déterminées par ELISA. L'infection WT VACV des BMDC n'a pas réussi à induire la production d'IFN-β. Parmi tous les mutants de délétion, seul VACV∆E5R a induit la sécrétion d'IFN-β à partir des BMDC WT, mais pas à partir des BMDC cGAS − / − (Fig. 1d). VACV∆E5R-E5R-Flag dans lequel E5R a été remplacé par E5R-Flag n'a pas réussi à induire la sécrétion d'IFN-β, ce qui signifie que E5R-Flag est biologiquement actif (Fig. 1d). De plus, bien que B2 (codé par le gène B2R) ait été identifié comme une nucléase cGAMP19, l'infection par VACV∆B2R n'a pas induit de sécrétion d'IFN-β par les BMDC WT (Fig. 1d), suggérant la présence d'autres inhibiteurs viraux de la voie cGAS/STING/IFNB dans VACV∆B2R. De plus, l'infection par VACV∆E5R des BMDC WT a induit la production de cGAMP, indiquant l'activation de cGAS (Fig. 1e). Ces résultats démontrent que l'E5R de la vaccine code pour un inhibiteur majeur de cGAS.

Vaccinia E5 est un polypeptide de 341 acides aminés comprenant un domaine alpha-hélicoïdal N-terminal (acides aminés 60–106) et deux domaines BEN à l'extrémité C-terminale (acide aminé 112–222 et acide aminé 233–328) (Fig. 2a supplémentaire). BEN a été nommé pour sa présence dans BANP/SMAR1, poxvirus E5R et NAC120, et les protéines contenant le domaine BEN fonctionnent dans la liaison à l'ADN, l'organisation de la chromatine et la répression transcriptionnelle34,35,36. E5R est conservé parmi les orthopoxvirus (Fig. 2b. c supplémentaire) mais moins parmi les yatapoxvirus et le virus du myxome. Cependant, les orthologues E5R sont absents dans les parapoxvirus, les entomopoxvirus, la variole aviaire et les virus du molluscum contagiosum (données non présentées). Les protéines E5 de la vaccine (souche Western Reserve (WR) et souche de Copenhague), de la variole (l'agent causal de la variole) et des virus du cowpox contiennent une séquence supplémentaire de 10 acides aminés aux extrémités N-terminales par rapport aux protéines E5 de la vaccine (Ankara), MVA et ectromelia (mousepox) (Fig. 2c supplémentaire). Fait intéressant, Monkeypox E5 présente de grandes délétions à la fois à ses extrémités N et C (Fig. 2c supplémentaire)37.

Pour tester si la vaccine E5 est un facteur de virulence, nous avons réalisé une expérience d'infection intranasale avec WT VACV ou VACV∆E5R (2 × 106 pfu) chez des souris WT C57BL/6J. Toutes les souris infectées par WT VACV ont perdu du poids rapidement, à partir du troisième jour de l'infection, et sont mortes ou ont été euthanasiées en raison d'une perte de poids de plus de 30 % aux jours 7 à 8 après l'infection (Fig. 2a, b). En revanche, les souris infectées par VACV∆E5R ont perdu en moyenne près de 15 % de leur poids corporel initial au jour 6 après l'infection, puis se sont rétablies (Fig. 2a, b). Pour exclure la possibilité que VACV∆E5R présente une atténuation de la réplication, nous avons comparé les tailles de plaque et la cinétique de réplication entre WT VACV et VACV∆E5R dans des cellules BSC40. Nous avons constaté que VACV∆E5R était compétent pour la réplication et présentait une cinétique de réplication similaire à celle de WT VACV in vitro (Fig. 3a, b supplémentaires). Cependant, l'infection intranasale de WT VACV à 2 × 105 pfu a entraîné des titres beaucoup plus élevés dans les poumons, la rate, le foie et le sang infectés au jour 6 après l'infection par rapport aux tissus prélevés sur des souris C57BL / 6J infectées par VACV∆E5R (2 × 107 pfu) au jour 6 après l'infection (Fig. 3c supplémentaire). Ces résultats démontrent que bien que le VACV∆E5R ait une capacité de réplication similaire à celle du WT VACV in vitro, il est atténué in vivo, probablement en raison des réponses immunitaires innées de l'hôte induites par l'infection par le VACV∆E5R. Les titres viraux réduits dans divers tissus après l'infection par VACV∆E5R sont corrélés à une perte de poids moindre et à une meilleure survie des animaux infectés (Fig. 2a, b). Ces résultats indiquent que VACV∆E5R est atténué par rapport à WT VACV et démontrent ainsi que E5 est un facteur de virulence. De plus, VACV∆E5R (2 × 107 pfu) a gagné en virulence chez les souris cGas−/− ou Stinggt/gt mais est resté atténué chez les souris Mda5−/−, indiquant que la voie de détection de l'ADN cytosolique médiée par cGAS ou STING est indispensable pour la défense de l'hôte contre l'infection intranasale par VACV∆E5R (Fig. 2c, d). De plus, nous avons détecté de l'IFN-β dans le lavage bronchoalvéolaire (BALF) 48 h après l'infection par VACV∆E5R (Fig. 2e), indiquant qu'une infection intranasale par une infection par VACV∆E5R pourrait induire la production d'IFN-β in vivo.

a, b Pourcentages du poids initial (a) et courbes de survie de Kaplan – Meier (b) des souris WT C57BL / 6J (n = 5 dans chaque groupe) au cours des jours suivant l'infection intranasale avec WT VACV ou VACV∆E5R à une dose de 2 × 106 pfu par souris. c, d Pourcentages du poids initial (c) et courbes de survie de Kaplan–Meier (d) des souris WT, Mda5−/−, cGas−/− ou Stinggt/gt (n = 5 dans chaque groupe) au cours des jours post-infection intranasale avec VACV∆E5R à une dose de 2 × 107 pfu par souris. e Analyse ELISA des niveaux d'IFN-β dans le BALF récolté sur des souris WT 48 h après l'infection avec WT VACV ou VACV∆E5R à une dose de 2 × 107 pfu par souris. n = 5 échantillons indépendants. f Schéma de principe du révertant pleine longueur VACV E5R et de divers mutants de troncature VACV E5R. g Analyse RT-qPCR des niveaux d'Ifnb dans les BMDC WT infectés par différents virus de la vaccine, y compris VACV, VACV∆E5R, révertant VACV-E5R-FL et divers mutants de troncature VACV E5R à MOI de 10 pendant 6 h. n = 3 échantillons indépendants. h, i Pourcentages du poids initial (h) et courbes de survie de Kaplan – Meier (i) des souris WT C57BL / 6J (n = 5 dans chaque groupe) au cours des jours suivant l'infection intranasale avec VACV∆E5R, VACV-E5R-révertissant de pleine longueur et divers mutants de troncature E5R à une dose de 2 × 107 pfu par souris. Le test t de Student non apparié à deux queues a été utilisé pour les comparaisons de deux groupes dans les études. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour déterminer quel(s) domaine(s) de E5 sont nécessaires pour l'inhibition médiée par E5 de l'induction et de la virulence de l'IFNB, nous avons construit VACV-E5R (pleine longueur; FL) et une série de ses mutants de troncature (Fig. 2f). Les BMDC ont été infectés par les mutants de troncature WT VACV, VACV∆E5R, VACV-E5R-FL et E5R. L'expression de Vaccinia C7 a été déterminée par analyse Western blot pour vérifier l'infection virale (Fig. 3d supplémentaire). Une PCR quantitative en temps réel a été utilisée pour déterminer l'expression du gène Ifnb1 dans les BMDC infectés. Alors que VACV-E5R (pleine longueur) n'induisait que légèrement l'expression du gène Ifnb1 dans les cellules BMDC (Fig. 2g), tous les mutants de troncature E5R induisaient l'expression du gène Ifnb1 à un niveau similaire à VACV∆E5R (Fig. 2g). De plus, l'infection intranasale des mutants de troncature VACV-E5R (pleine longueur) et E5R (2 × 107 pfu) chez les souris C57BL/6J a montré que seule l'infection VACV-E5R (pleine longueur) était létale, tandis que tous les mutants de troncature provoquaient une perte de poids transitoire mais 100 % de survie, à l'exception de VACV-E5R∆224N (avec 80 % de survie) (Fig. 2 h, je). Ces résultats ont démontré que tous les domaines E5, y compris le domaine alpha-hélicoïdal N-terminal et les deux domaines BEN, sont nécessaires à la répression de l'expression et de la virulence du gène Ifnb.

Pour déterminer si le gène E5R du génome du MVA code pour une protéine fonctionnelle, nous avons généré MVA∆E5R. L'infection par le MVA∆E5R des BMDC a fortement régulé à la hausse l'expression des gènes Ifnb1, Ifna, Ccl4 et Ccl5 (Fig. 3a), alors que l'infection par le MVA a eu une induction modeste. L'infection par le MVA∆E5R des BMDC a induit des niveaux de sécrétion d'IFN-β beaucoup plus élevés que le MVA, le MVA inactivé par la chaleur (chaleur-iMVA) ou le MVA∆E5R inactivé par la chaleur (chaleur-iMVA∆E5R) (Fig. 3b). L'expression de Vaccinia E3L était comparable entre MVA et MVA∆E5R (Fig. 3c). L'expression du gène E3L n'a pas été détectée dans les BMDC infectés par le MVA inactivé par la chaleur (Heat-iMVA) ou le MVA∆E5R (Heat-iMVA∆E5R) inactivé par la chaleur comme prévu. L'induction de l'IFN-β dans les BMDC dépendait des doses virales (Fig. 4a supplémentaire). La sécrétion d'IFN-α a également été fortement induite par l'infection par le MVA∆E5R dans les BMDC (Fig. 3d). De plus, MVA∆E5R a provoqué des niveaux beaucoup plus élevés de production de cGAMP dans les BMDC que MVA (Fig. 3e), ce qui suggère que E5 cible le cGAS.

une RT-qPCR de l'expression des gènes Ifnb1, Ifna, Ccl4 et Ccl5 dans les BMDC WT infectés par MVA ou MVA∆E5R à un MOI de 10 pendant 6 h. n = 3 échantillons indépendants. b Analyses ELISA des niveaux d'IFN-β ou d'IFN-α dans les surnageants de BMDC WT infectés par MVA, MVA∆E5R, Heat-iMVA ou Heat-iMVA∆E5R à un MOI de 10 pendant 16 h. n = 3 échantillons indépendants. c Analyse RT-qPCR de l'expression du gène E3 dans les BMDC WT infectés par différents virus de la vaccine à MOI de 10 pendant 16 h. n = 3 échantillons indépendants. d Analyses ELISA des niveaux d'IFN-α dans les surnageants de BMDC WT infectés par MVA ou MVA∆E5R à un MOI de 10 pendant 16 h. n = 3 échantillons indépendants. e Analyses ELISA des niveaux de cGAMP dans les BMDC WT infectés par le MVA ou le MVA∆E5R à un MOI de 10 pendant 16 h. n = 3 échantillons indépendants. f Analyses ELISA des niveaux d'IFN-β dans le BMDC de souris WT, cGas−/−, Stinggt/gt, Irf3−/− et Irf7−/− infectées par MVA ou MVA∆E5R à un MOI de 10 pendant 16 h. n = 3 échantillons indépendants. ***p < 0,001. Le test t de Student non apparié à deux queues a été utilisé pour les comparaisons de deux groupes dans les études. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Semblable au BMDC, l'infection par le MVA∆E5R des macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMM) ou des fibroblastes dermiques primaires a également induit des niveaux de sécrétion d'IFN-β beaucoup plus élevés que le MVA (Fig. 4b, c supplémentaires). Ces résultats ont démontré que la vaccine E5 bloque l'activation de cGAS et que la suppression de E5R du génome du MVA active puissamment la voie cGAS/STING dans plusieurs types de cellules myéloïdes. De plus, la sécrétion d'IFN-β induite par MVA∆E5R par les BMDC a été abolie dans les cellules cGAS−/− ou STINGGt/Gt et diminuée dans les cellules IRF3−/− ou IRF7−/− (Fig. 3f). En plus des BMDC, la sécrétion d'IFN-β induite par le MVA∆E5R dans les BMM ou les fibroblastes primaires dépendait également de la voie cGAS / STING (Fig. 4b, c supplémentaires). Ces résultats démontrent que la voie de détection de l'ADN cytosolique médiée par cGAS/STING et les facteurs de transcription IRF3 et IRF7 sont nécessaires pour la sécrétion d'IFN-β induite par MVA∆E5R dans divers types de cellules primaires.

En plus de l'ADN viral parental fourni par les virions entrants, l'ADN viral de descendance généré après la réplication de l'ADN dans les virosomes peut également stimuler le capteur d'ADN cytosolique cGAS, entraînant la production d'IFN-β. Pour évaluer cela, nous avons utilisé du phosphonoacétate (PAA) ou de l'aphidicoline pour bloquer la réplication de l'ADN viral38,39. Le traitement au PAA ou à l'aphidicoline des MEF infectés par MVA∆E5R a bloqué la formation de virosomes comme prévu (Fig. 4d supplémentaire) et a aboli l'expression de gènes viraux tardifs tels que A27 et A34 (Fig. 4e supplémentaire). Les expressions des gènes Ifnb1 et Ifna induites par MVA∆E5R ont été partiellement réduites en présence de PAA ou d'aphidicoline (Fig. 2e supplémentaire). Dans l'ensemble, nos résultats indiquent que l'ADN viral parental et de descendance des BMDC infectés par le MVA∆E5R contribue à l'induction de l'IFN de type I.

Pour étudier comment E5 antagonise la voie cGAS/STING, nous avons d'abord évalué les niveaux de protéine cGAS après l'infection par WT VACV. Nous avons observé que les niveaux de protéine cGAS étaient inférieurs six heures après l'infection par WT VACV dans les BMDC par rapport au contrôle de l'infection fictive (Fig. 4a), ce qui suggère que la protéine cGAS pourrait être dégradée après une infection virale. Le traitement avec l'inhibiteur de protéasome MG132 a empêché la dégradation du cGAS, tandis que le traitement avec un inhibiteur de pan-caspase, le Z-VAD ou un inhibiteur de l'AKT1/2 VIII a eu peu d'effet sur les niveaux de cGAS (Fig. 4a). Le traitement avec le cycloheximide (CHX), inhibiteur de la traduction des protéines, a partiellement bloqué la dégradation du cGAS, ce qui suggère que les protéines virales nouvellement synthétisées pourraient faciliter la dégradation du cGAS (Fig. 4a). Le niveau de protéine C7 de la vaccine dans les cellules infectées a été utilisé pour vérifier l'infection et les effets des médicaments. Par exemple, la protéine C7 était absente dans les cellules infectées par WT VACV en présence de CHX (Fig. 4a). Ces résultats indiquent que la dégradation du cGAS induite par le WT VACV dépend du protéasome. Contrairement au WT VACV, l'infection par VACV∆E5R des BMDC n'a pas entraîné de dégradation du cGAS (Fig. 4b). De même, alors que l'infection par le MVA des BMDC a déclenché la dégradation du cGAS, l'infection par le MVA∆E5R ne l'a pas fait (Fig. 4c), confirmant que l'E5 contribue à la dégradation du cGAS dans le contexte d'une infection par le VACV ou le MVA.

a Immunoblot de cGAS dans des MEF infectés par WT VACV à un MOI de 10 pendant 6 h. Les cellules ont été prétraitées avec du cycloheximide (CHX, 25 µg/mL), un inhibiteur de protéasome MG132 (25 µM), un inhibiteur de pan-caspase Z-VAD (50 µM), un inhibiteur d'AKT1/2 VIII (10 µM) pendant 30 min, puis infectées avec WT VACV en présence de chaque médicament individuel. Les cellules ont été collectées 6 h après l'infection. b, c Immunoblot de cGAS dans des BMDC infectés par le virus indiqué à un MOI de 10. Les cellules ont été prétraitées avec ou sans MG132 (25 µM) pendant 30 min avant d'être infectées par le virus. Les cellules ont été recueillies au moment indiqué après l'infection. d Les BMDC ont été infectés par le MVA à un MOI de 10. Aux moments indiqués, les cellules ont été collectées et les protéines ubiquitinées totales ont été extraites par des billes Halo-4xUBAUBQLN1. Les cGAS ubiquitinés ont été détectés par l'anticorps anti-cGAS. mUB-cGAS cGAS monoubiquitiné, Poly-UB-cGAS cGAS polyubiquitiné, PD pull-down. Les cellules HEK293T ont été co-transfectées avec des plasmides exprimant V5 – cGAS et HA-Ub (WT ou K48 uniquement). Vingt-quatre heures plus tard, les cellules ont été infectées avec MVA ou MVAΔE5R à MOI 10 pendant 6 h en présence de MG132 (25 µM). Le cGAS a été abaissé par un anticorps anti-V5 et le cGAS ubiquitiné a été déterminé par un anticorps anti-HA. Immunoprécipitation IP. Lysats de cellules entières WCL. f Images confocales représentatives montrant l'emplacement du drapeau E5 dans les BMDC après une infection par MVAΔE5R-E5-Flag ou MVAΔE5R-E5R95K-Flag à un MOI 10 pendant 6 h. E5-Flag a été coloré par un anticorps anti-Flag. Barre d'échelle, 50 μm. g Immunoblot de E5-Flag dans des extraits cytoplasmiques et nucléaires de BMDC infectés par MVAΔE5R-E5-Flag ou MVAΔE5R-E5R95K-Flag à MOI de 10 pendant 6 h. Extrait cytoplasmique CE, extrait nucléaire NE. h Analyses ELISA des niveaux d'IFN-β dans les surnageants de BMDC infectés par MVA, MVA∆E5R, MVAΔE5R-E5-Flag ou MVAΔE5R-E5R95K-Flag à un MOI de 10 pendant 16 h. n = 3 échantillons indépendants. Le test t de Student non apparié à deux queues a été utilisé pour les comparaisons de deux groupes dans les études. Les données sont représentatives de deux (f) ou trois (a-e) expériences indépendantes et présentées sous forme de moyenne ± SEM. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour tester si l'infection par le MVA des BMDC déclenche l'ubiquitination du cGAS endogène, les BMDC ont été infectés par le MVA à un MOI de 10 en présence de MG132 pendant les durées indiquées. Les protéines ubiquitinées totales de BMDC infectées par le MVA ont été enrichies par des billes Halo-4 × UBAUBQLN1, qui contiennent quatre domaines associés à l'ubiquitine (UBA) en tandem d'Ubiquilin-1 pour extraire spécifiquement les protéines ubiquitinées40. Les bandes cGAS monoubiquitinées et polyubiquitinées ont été détectées dès 2 h après l'infection et ont augmenté à 4 et 6 h après l'infection (Fig. 4d). Ce schéma d'ubiquitination était en corrélation avec la cinétique de dégradation du cGAS. Nous avons également détecté du cGAS non modifié dans tous les échantillons, ce qui est très probablement dû à la liaison non spécifique du cGAS non modifié aux billes et/ou à la formation de complexes oligomères avec le cGAS ubiquitiné.

Nous avons émis l'hypothèse que la vaccine E5 pourrait induire l'ubiquitination de cGAS et la dégradation subséquente dépendante du protéasome. Pour tester cela, des cellules HEK293T ont été co-transfectées avec des plasmides exprimant V5 – cGAS et HA-Ub (WT ou K48 uniquement). Vingt-quatre heures plus tard, les cellules ont ensuite été infectées par le MVA ou le MVAΔE5R en présence de MG132. Le cGAS a été abaissé par un anticorps anti-V5 et le cGAS ubiquitiné a été déterminé par un anticorps anti-HA. Nous avons détecté des niveaux plus élevés d'ubiquitination cGAS, en particulier de poly-ubiquitination liée à K48, dans les cellules infectées par le MVA par rapport à celles infectées par le MVA∆E5R (Fig. 4e). Ainsi, nos résultats suggèrent que E5 exprimé par MVA favorise la poly-ubiquitination de cGAS liée à K48, conduisant à sa dégradation.

Pour visualiser l'expression de E5, nous avons généré un virus recombinant MVA∆E5R-E5-Flag. L'imagerie confocale des BMDC infectés par MVA∆E5R-E5-Flag a montré à la fois la localisation cytoplasmique et noyau de E5 (Fig. 4f). L'analyse par Western blot a confirmé que E5 était exprimé à la fois dans le cytoplasme et le noyau (Fig. 4g). GAPDH a été utilisé comme contrôle positif pour la protéine cytoplasmique et Lamin B1 a été utilisé comme contrôle positif pour la protéine du noyau. De plus, l'infection par MVA∆E5R-E5-Flag des BMDC a entraîné une production d'IFN-β bien inférieure à celle de MVA∆E5R (Fig. 4h), ce qui indique que le marquage de E5 avec Flag à l'extrémité C-terminale de la protéine a conservé sa fonction inhibitrice sur la voie cGAS / STING. Dans le processus de génération du virus MVA∆E5R-E5-Flag à l'aide de la sélection de médicaments, nous avons isolé une souche mutante, MVA∆E5R-E5R95K-Flag, qui contient un seul changement de nucléotide (G284A), entraînant le remplacement de l'arginine à l'acide aminé 95 de E5 par la lysine. E5R95K-Flag était exprimé dans le cytoplasme mais pas dans le noyau des BMDC infectés par MVA∆E5R-E5R95K-Flag (Fig. 4f). Western blot a confirmé que seule la protéine E5R95K-Flag cytoplasmique mais pas du noyau a été détectée après une infection par MVA∆E5R-E5R95K-Flag dans les BMDC (Fig. 4g). De plus, la production d'IFN-β a été diminuée dans les BMDC infectés par MVA∆E5R-E5R95K-Flag (Fig. 4h), ce qui était similaire à celle produite par les BMDC infectés par MVA∆E5R-E5-FLAG, indiquant que l'E5 cytoplasmique est suffisant pour supprimer la production d'IFN de type I.

Pour tester si E5 seul peut déclencher la dégradation de cGAS sans infection virale, nous avons co-transfecté un plasmide exprimant cGAS avec un plasmide exprimant E5R ou un vecteur vide dans des cellules HEK293T. 24 h plus tard, les cellules ont été infectées avec MVAΔE5R à un MOI de 10 pendant 6 h. Nous avons observé que le niveau de cGAS était diminué après co-transfection avec le plasmide exprimant E5R mais pas avec le vecteur vide (Fig. 5a). De plus, l'infection par MVA∆E5R n'a pas réussi à améliorer la dégradation du cGAS médiée par E5 (Fig. 5a), ce qui indique que E5 seul peut déclencher la dégradation du cGAS, probablement dans le contexte de la transfection de plasmide. Ensuite, nous avons testé si la surexpression de E5 via la transduction lentivirale dans les MEF entraînait également une dégradation du cGAS. Les MEF ont été transduits avec un vecteur lentiviral exprimant mcherry ou E5-Flag. Quarante-huit heures plus tard, les lysats cellulaires ont été collectés et l'expression de cGAS a été déterminée. Nous avons observé que la surexpression de E5-Flag réduisait également les niveaux de cGAS endogènes dans les MEF (Fig. 5b).

a Les cellules HEK293T ont été co-transfectées avec les plasmides V5 – cGAS et pcDNA-E5R-Flag ou pcDNA3.1. Vingt-quatre heures plus tard, les cellules ont été infectées avec MVAΔE5R à un MOI de 10 pendant 6 h. Les niveaux de protéines V5–cGAS ont été déterminés par un anticorps anti-V5. La protéine C7 a été mesurée pour indiquer une infection par MVAΔE5R. b Les cellules MEF ont été infectées par un rétrovirus exprimant E5R-Flag ou mcherry. Quarante-huit heures plus tard, les niveaux de protéine cGAS ont été déterminés par un anticorps anti-cGAS. c Les cellules HEK293T ont été transfectées avec les plasmides V5 – cGAS et pcDNA-E5R-Flag ou pcDNA3.1. Vingt-quatre heures plus tard, les lysats cellulaires ont été traités avec ou sans Benzonase (250 U/mL). V5 – cGAS a été abaissé par un anticorps anti-V5 et E5-Flag a été déterminé par un anticorps anti-Flag. d Les BMDC de souris WT ou cGas−/− ont été infectées avec MVAΔE5R-E5R-Flag à un MOI de 10 pendant 6 h. Les lysats cellulaires ont été traités avec ou sans Benzonase (250 U/mL). cGAS a été abaissé par un anticorps anti-cGAS et E5-Flag a été déterminé par un anticorps anti-Flag. e Images confocales représentatives montrant les emplacements E5-Flag et cGAS dans les BMDC après infection par MVAΔE5R-E5-Flag à un MOI 10 pendant 6 h. E5-Flag a été coloré par un anticorps anti-Flag. Le cGAS endogène a été coloré par un anticorps anti-cGAS. Barre d'échelle, 15 μm. f Les cellules HEK293T ont été transfectées avec les plasmides V5 – cGAS et pcDNA-E5R-Flag ou pcDNA3.1. Vingt-quatre heures plus tard, les cellules ont été collectées après avoir été traitées avec MG132 (25 µM) pendant 6 h, et les protéines ubiquitinées totales ont été extraites par des billes Halo-4xUBAUBQLN1. Les cGAS ubiquitinés ont été détectés par l'anticorps anti-cGAS. mUB-cGAS cGAS monoubiquitiné, Poly-UB-cGAS cGAS polyubiquitiné, PD pull-down. g Le modèle de travail de la vaccine E5 antagonise le cGAS cytoplasmique. Les données sont représentatives de deux (e) ou trois (a–d) expériences indépendantes et présentées sous forme de moyenne ± SEM. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour évaluer si E5 et cGAS interagissent, nous avons transfecté des cellules HEK293T avec le plasmide d'expression V5 – cGAS et E5-Flag. L'immunoprécipitation avec l'anticorps anti-V5 a abaissé le drapeau E5, indiquant ainsi une interaction E5 – cGAS (Fig. 5c). Pour tester si l'ADN est nécessaire pour la médiation de l'interaction E5 et cGAS, les lysats cellulaires ont été traités avec ou sans Benzonase, une endonucléase qui élimine à la fois l'ADN et l'ARN. Le traitement à la benzonase n'a pas réussi à perturber l'interaction E5 – cGAS, ce qui indique qu'une telle interaction n'est pas médiée par l'ADN (Fig. 5c). Ensuite, nous avons testé si E5-Flag exprimé par MVA∆E5R-E5-Flag interagissait avec le cGAS endogène dans les BMDC. En bref, les BMDC WT et cGAS − / − ont été infectés par MVA∆E5R-E5-Flag à un MOI de 10 pendant 6 h. Les lysats cellulaires ont été traités avec ou sans Benzonase. cGAS a été abaissé par un anticorps anti-cGAS et E5-Flag a été déterminé par un anticorps anti-Flag. Le test de co-immunoprécipitation a montré que dans les BMDC WT, le cGAS interagissait avec E5-Flag et le traitement à la benzonase n'a pas réussi à perturber l'interaction (Fig. 5d). Nous n'avons pas réussi à détecter une telle interaction dans les cGAS−/− BMDC. Nous avons également visualisé la co-localisation de E5-Flag et de cGAS endogène dans les BMDC infectés par MVA∆E5R – E5-Flag (Fig. 5e). De plus, la co-transfection des plasmides exprimant cGAS et E5R dans les cellules HEK293T a favorisé une ubiquitination cGAS plus forte que cGAS seul (Fig. 5f). Collectivement, en utilisant des approches de transfection plasmidique, de transduction lentivirale et d'infection MVA∆E5R – E5-Flag dans plusieurs types de cellules de mammifères, notamment HEK293T, MEF et BMDC, nous avons démontré des interactions entre E5 et cGAS, qui sont indépendantes de la liaison à l'ADN. Nos résultats démontrent également que E5 améliore l'ubiquitination de cGAS et la dégradation ultérieure via un mécanisme dépendant du protéasome (Fig. 5g).

Le MVA a été étudié comme vecteur vaccinal pour diverses maladies infectieuses10, telles que le VIH, la tuberculose, le paludisme, Ebola et le SRAS-CoV-2, et l'infection par le MVA active modestement les DC dérivées de monocytes humains (moDC)41. Pour déterminer si la suppression d'E5R améliore l'immunogénicité du vecteur viral, nous avons d'abord généré MVA∆E5R-OVA, exprimant un modèle d'ovalbumine de poulet (OVA), puis comparé la maturation des DC lors de l'infection par MVA∆E5R-OVA par rapport à MVA-OVA. Nous avons observé que l'infection par MVA∆E5R-OVA induisait des niveaux plus élevés d'expression de CD86 et de CD40 par rapport à MVA-OVA 24 h après l'infection (Fig. 6a – c). Cependant, l'expression de CD86 et de CD40 induite par MVA∆E5R-OVA et MVA-OVA a diminué dans les cGAS − / − BMDC, ce qui indique que la voie de détection de l'ADN cytosolique est essentielle pour la maturation des DC induite par MVA∆E5R-OVA ou MVA-OVA (Fig. 6a – c).

a–c Diagrammes de points représentatifs de cytométrie en flux (a, b) ou analyse (c) de l'expression de CD86 et CD40 dans WT ou cGas−/− BMDC infecté par MVA-OVA ou MVAΔE5R-OVA à MOI 10 pendant 16 h. n = 3 échantillons indépendants. d Carte thermique montrant l'expression relative de certains gènes liés au système immunitaire dans l'infection WT ou cGas−/− BMDC avec MVA ou MVA∆E5R. Ceux-ci comprennent des gènes impliqués dans la présentation de l'antigène, l'activation des DC, l'IFN et les cytokines et chimiokines pro-inflammatoires, ainsi que les capteurs immunitaires innés. e Réponses des lymphocytes T spécifiques de l'antigène après vaccination avec MVA-OVA ou MVA∆E5R-OVA. Des souris C57BL/6J ont été vaccinées avec MVA-OVA ou MVAΔE5R-OVA par scarification cutanée (SS) ou injection intradermique (ID). Une semaine plus tard, la rate et les ganglions lymphatiques drainants (dLN) ont été récoltés, et les lymphocytes T CD8 + spécifiques à SIINFEKL dans les splénocytes et les lymphocytes T CD8 + ou Th1 CD4 + spécifiques au tétramère OVA dans les ganglions lymphatiques ont été déterminés par FACS. n = 5 échantillons indépendants. Le test t de Student non apparié à deux queues a été utilisé pour les comparaisons de deux groupes dans les études. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

L'analyse ARN-seq des BMDC WT ou cGAS−/− infectés ou faussement infectés par le MVA ou le MVA∆E5R a démontré que l'infection par le MVA∆E5R dans les BMDC WT induisait des niveaux plus élevés d'IFN de type I et de gènes de cytokines et de chimiokines pro-inflammatoires, notamment Ifnb1, Ccl5, Ccl12, Il12b, Il6, Il27, des marqueurs de maturation et d'activation des DC tels que CD86 , CD40 et CD69, ainsi que des gènes impliqués dans la présentation croisée de l'antigène, notamment Tap1, H2-Q4, H2-Q6 et H2-Q7, par rapport à MVA (Fig. 6d et Supplémentaires Fig. 5a, b). La régulation à la hausse de ces gènes par le MVA et le MVA∆E5R était dépendante du cGAS (Fig. 6d et Supplémentaires Fig. 5a, c).

Ensuite, nous avons effectué une vaccination par injection SS ou intradermique (ID) avec MVA-OVA ou MVA∆E5R-OVA. Une semaine après la vaccination, les lymphocytes T anti-OVA CD8+ et Th1 CD4+ de la rate et des ganglions lymphatiques drainants ont été analysés. La vaccination avec MVA∆E5R-OVA a entraîné la présence de plus de lymphocytes T CD8 + spécifiques à l'OVA dans la rate que le MVA-OVA (Fig. 6e). Et plus de lymphocytes T CD8 + ou Th1 CD4 + spécifiques à l'OVA ont été détectés dans les ganglions lymphatiques drainants (dLN) après la vaccination MVA∆E5R-OVA, par rapport au MVA-OVA (Fig. 6e). Ces résultats fournissent la preuve que la délétion du gène E5R du MVA augmente les réponses des lymphocytes T spécifiques de l'antigène après les vaccinations.

L'identification de la vaccine E5 en tant qu'inhibiteur majeur du capteur d'ADN cytosolique cGAS met en évidence l'importance de cette voie dans la défense de l'hôte contre l'infection par le poxvirus. E5, membre fondateur de la famille du domaine BEN, est conservé parmi les orthopoxvirus. Ici, nous montrons que le facteur de virulence E5 se lie au cGAS, déclenchant l'ubiquitination du cGAS et la dégradation dépendante du protéasome et que la suppression de l'E5R du vecteur viral MVA améliore son immunogénicité.

Les poxvirus virulents, y compris le VACV (souches WR et Copenhagen), le cowpox et le virus de l'ectromélie, ne parviennent pas à activer STING, contrairement au dérivé hautement atténué, le MVA42,43. De plus, l'infection par le MVA mais pas le WT VACV des BMDC induit la production de cGAMP, ce qui suggère que le VACV code pour un ou plusieurs inhibiteurs du cGAS. Grâce à un criblage impartial de 80 gènes de la vaccine, nous avons identifié plusieurs gènes candidats qui pourraient coder des inhibiteurs de cGAS, notamment E5R, K7R, C11R, WR199/B18R et WR200/B19R. Nous nous sommes ensuite concentrés sur E5R car un mutant VACV dépourvu d'E5R a induit une quantité modérée de sécrétion d'IFN-β et de production de cGAMP dans les BMDC, tandis que les mutants VACV dépourvus d'autres gènes candidats individuels (y compris B2R, E3L, C11R, WR199, WR200, K7R et C7L) n'ont pas réussi à induire la sécrétion d'IFN-β dans les BMDC. Dans nos conditions, le VACV dépourvu du gène B2R, qui code pour une nucléase cGAMP, ne parvient pas à induire la production d'IFN de type I dans le BMDC, ce qui suggère qu'il pourrait y avoir une ou plusieurs protéines virales de la vaccine supplémentaires antagonistes de la voie cGAS/STING.

Contrairement au VACV de type sauvage, l'infection par le MVA des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse induit un IFN de type I d'une manière dépendante de cGAS/STING43. Notre étude a montré que l'E5 dans le MVA est toujours fonctionnel car la suppression du gène E5R du MVA améliore considérablement l'induction d'IFN de type I dans les BMDC, les BMM et les fibroblastes primaires. D'autre part, la présence d'E5 dans le MVA ne parvient pas à bloquer complètement la production d'IFN, ce qui pourrait être attribué à l'absence de WR200/B19R fonctionnel (IFNAR), de B2R ou d'autres inhibiteurs potentiels15. Des études antérieures ont démontré que plusieurs protéines virales de la vaccine ciblent l'induction d'IFN de type I induite par l'ADN, telles que B2, C4, C16, F17, N2 et C619,44,45,46,47,48,49. Plus précisément, C4 et C16 ciblent un autre capteur d'ADN, DNA-PK, qui joue un rôle dans l'activation de l'IRF3 dans les fibroblastes44,45,50, et les deux sont mutés ou perdus dans MVA15.

Bien que E5 ait été identifié pour la première fois par spectrométrie de masse comme l'une des trois principales protéines virales précoces associées aux virosomes dans les cellules infectées par la vaccine33, la fonction de E5 est restée insaisissable. E5 a également été trouvé dans les virions hautement purifiés par spectrométrie de masse après réticulation chimique, et plusieurs partenaires d'interaction ont été identifiés, notamment les sous-unités d'ARN polymérase RAP94, RP147 et NTP151. Ici, nous montrons la présence d'E5 dans le noyau et le cytoplasme des cellules infectées. Dans les cellules infectées par MVA∆E5R-E5R95K-Flag, E5R95K se localise uniquement dans le cytoplasme mais est suffisant pour médier l'inhibition de l'IFN. La mutation R95K se situe dans un signal de localisation nucléaire putatif de E5, 92KFKRMIR98.

Nous montrons que E5 médie la dégradation du cGAS via une voie dépendante du protéasome. Nous proposons le modèle de travail suivant basé sur nos résultats (Fig. 5g). Le virus de la vaccine pénètre dans les cellules hôtes par macropinocytose52. Lors de l'entrée virale, l'ADN viral est détecté par le capteur d'ADN cytosolique cGAS, dont l'activation conduit à la production de cGAMP et à la stimulation ultérieure de STING. Cependant, en présence de la vaccine E5, qui est principalement synthétisée par les virions entrants en tant que protéine virale précoce, le cGAS est ciblé pour l'ubiquitination et la dégradation dépendante du protéasome en interagissant avec E5. Cela conduit à une réduction de la production de cGAMP et de l'expression du gène Ifnb1. Il est possible que E5 soit ciblé par des protéines hôtes telles que les ISG. Nous n'avons pas été en mesure de montrer une interaction directe entre cGAS et E5 en raison de l'incapacité à générer une protéine E5 recombinante malgré de nombreuses tentatives dans différents systèmes d'expression de protéines, y compris des systèmes d'expression bactérienne utilisant Escherichia coli, des systèmes d'expression de cellules d'insectes utilisant Sf9 et des systèmes d'expression de cellules de mammifères. utilisant l'ovaire de hamster chinois. Bien que nous ayons pu montrer l'interaction E5 et cGAS via la co-immunoprécipitation dans plusieurs systèmes expérimentaux, qui n'a pas été perturbée par le traitement à la Benzonase, nous ne pouvons pas conclure que cGAS et E5 ont une interaction directe dans cette étude. De plus, nous avons observé que certains des E5 nouvellement exprimés sont transloqués vers le noyau. Il a été rapporté que le cGAS nucléaire est inhibé par les nucléosomes53,54. Les fonctions exactes de l'E5 nucléaire nécessitent une enquête plus approfondie.

Nous avons précédemment signalé que la réplication virale n'est pas importante pour la détection du MVA dans les BMDC43. Dans cette étude, cependant, l'expression du gène Ifnb1 induite par le MVA∆E5R a été partiellement réduite en présence des inhibiteurs de la réplication de l'ADN viral, du PAA et de l'aphidicoline. Ce résultat suggère que l'ADN de la descendance virosomale est détecté par cGAS dans le cadre d'une infection par le MVA∆E5R. Nous supposons qu'en présence de E5 pendant l'infection par le MVA, l'ADN de la descendance virosomale pourrait être protégé de la détection de cGAS.

Diverses modifications post-traductionnelles de cGAS ont été rapportées, notamment l'ubiquitination, la phosphorylation, l'acétylation, la sumoylation, l'ISGylation, la glutamylation, la neddylation et le clivage médié par la caspase55,56. Par exemple, il a été démontré que RNF185, une ligase d'ubiquitine E3 à domaine RING, interagit avec cGAS lors d'une infection par le virus simplex humain-1 (HSV-1), stimulant la poly-ubiquitination de cGAS liée à K27, importante pour l'activité enzymatique de cGAS57. TRIM56, une ligase d'ubiquitine E3 inductible par l'IFN, interagit avec cGAS pour favoriser la monoubiquitination et la production de cGAMP58. De plus, TRIM14, une protéine inductible par l'IFN, recrute USP14 pour cliver les chaînes de poly-ubiquitine liées à K48 de cGAS et inhibe ainsi la dégradation de cGAS via l'autophagie59. L'ubiquitine E3 ligase responsable de la poly-ubiquitination liée à K48 de cGAS reste insaisissable59. Ici, nous montrons que l'infection par le MVA induit la mono- et la poly-ubiquitination du cGAS et favorise sa dégradation de manière dépendante du protéasome. E5 est essentiel pour ce processus via l'interaction avec cGAS. Cependant, les détails exacts de la façon dont E5 recrute une ligase d'ubiquitine E3 virale ou cellulaire pour catalyser l'ubiquitination de cGAS restent à déterminer.

La découverte d'E5 en tant qu'inhibiteur majeur de cGAS fournit des informations importantes sur l'amélioration du MVA en tant que vecteur vaccinal. Ici, nous montrons que l'infection par le MVA∆E5R-OVA des BMDC induit des niveaux élevés de production d'IFN-β et de maturation des DC, ce qui est cohérent avec les modifications transcriptomiques dépendantes du cGAS induites par le MVA∆E5R. La vaccination avec MVA∆E5R-OVA induit des niveaux plus élevés de lymphocytes T CD8+ et Th1 CD4+ spécifiques à l'OVA par rapport au MVA-OVA. Des études récentes ont montré que les vecteurs vaccinaux à base de MVA exprimant la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 induisent de puissantes réponses immunitaires anti-spike des lymphocytes T et B et offrent une protection chez les souris, les hamsters et les macaques contre l'infection par le SRAS-CoV-2 et l'immunopathologie pulmonaire60,61,62,63,64. Une future enquête visant à déterminer si les vecteurs vaccinaux à base de MVA∆E5R améliorent l'efficacité du vaccin contre les agents infectieux tels que le SRAS-CoV-2 est justifiée.

Parmi tous les candidats inhibiteurs de cGAS codés par la vaccine identifiés dans cette étude, E5, K7, C11, WR199 / B18 et WR200 / B19, et B2 (poxine) précédemment rapportés, seule l'infection VACV∆E5R des BMDC a induit des niveaux significatifs d'IFN de type I (Fig. 1d). Étant donné que l'activation de la voie cGAS/STING dans les DC est essentielle pour la thérapie virale oncolytique induite par un virus65, la suppression de l'E5R et peut-être d'autres inhibiteurs de cette voie de la vaccine oncolytique améliorerait sa sécurité et son potentiel thérapeutique.

Notre recherche est conforme à toutes les réglementations éthiques pertinentes. Nous avons effectué toutes les procédures en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire de l'Institut national de la santé, et le protocole (# 19-01-002) a été approuvé par le Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Toutes les souris ont été hébergées dans l'animalerie exempte d'agents pathogènes spécifique au MSKCC dans les conditions suivantes : températures de 21,1 à 22,2 °C (70 à 72 °F), humidité de 30 à 70 % et cycle lumière/obscurité de 12 h 12 (les lumières étaient allumées de 6 h à 18 h). Les souris ont été euthanasiées à la fin de l'expérience avec asphyxie au CO2, avec dislocation cervicale comme méthode d'assurance physique secondaire.

Des souris C57BL/6J âgées de 6 à 8 semaines ont été achetées au Jackson Laboratory et ont été utilisées pour la préparation de cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse (BMDC) et pour des expériences d'infection intranasale. Les souris cGas-/- ont été achetées au Jackson Laboratory. Des souris Stinggt/gt ont été générées dans le laboratoire de Russell Vance (Université de Californie, Berkeley)66. Des souris Mda5−/− ont été générées dans le laboratoire de Marco Colonna (Washington University)67. Les souris Irf3-/- ont été fournies par Ruslan Medzhitov (Université de Yale). Des souris Irf7−/− ont été générées par Shizuo Akira (Université d'Osaka). Toutes les souris transgéniques sont de fond C57BJ/6J.

La souche WR du virus de la vaccine (VACV) (ATCC VR-1354) a été propagée et les titres de virus ont été déterminés sur des monocouches BSC40 (cellules rénales de singe vert africain) à 37 ° C. Le MVA a été gracieusement fourni par Gerd Sutter (Université de Munich) et propagé dans des cellules BHK-21 (cellule rénale de bébé hamster, ATCC CCL-10). MVA-OVA était un cadeau aimable du Dr Ingo Drexler (Université Heinrich Heine de Düsseldorf). Le VACV∆E3L a été gracieusement fourni par BL Jacobs (Arizona State University). Le virus VACV∆C11R a été gracieusement fourni par Bernard Moss (National Institutes of Health)68. Tous les virus ont été purifiés à travers un coussin de saccharose à 36 %. Heat-iMVA ou Heat-iMVA∆E5R a été généré en incubant le virus MVA ou MVA∆E5R purifié à 55 ° C pendant 1 heure. Pour générer le virus recombinant VACV∆E5R, des cellules BSC40 ont été infectées avec le virus de la vaccine WT (WR) à un MOI de 0,2. Après 1 à 2 h, les cellules ont été transfectées avec des plasmides pE5R-mCherry avec Lipofectamine 2000 (Invitrogen). La recombinaison homologue entre l'ADN plasmidique et le génome viral de la vaccine a entraîné la suppression du gène E5R du génome viral et l'insertion de mCherry, sous le contrôle du promoteur précoce et tardif synthétique de la vaccine (pSE/L). Les cellules ont été recueillies 2 jours plus tard et ont subi trois cycles de congélation-décongélation. La purification de la plaque a été effectuée sur la base de la fluorescence mCherry vue au microscope. Après 4 à 5 cycles, des virus recombinants purs VACV∆E5R-mCherry ont été obtenus et la validation de la délétion E5R a été confirmée par des analyses PCR et un séquençage d'ADN. Divers autres mutants de délétion, notamment VACV∆WR199, VACV∆K7R, VACV∆C7L exprimant mcherry, VACV∆B2R et VACV∆WR200 exprimant GFP, ont été générés selon une procédure similaire à celle décrite ci-dessus. VACV-E5R-FL, VACV-E5R∆59N, VACV-E5R∆106N, VACV-E5R∆224N, VACV-E5R∆117C et VACV-E5R∆235C ont été générés en insérant un E5R complet ou tronqué dans le locus E5R de VACV∆E5R. MVA∆E5R et MVA∆E5R-OVA exprimant mCherry ont été générés par recombinaison homologue au niveau des loci E4L et E6R flanquant le gène E5R du génome MVA ou MVA-OVA dans des cellules BHK21 en suivant une procédure similaire à celle décrite ci-dessus. MVA∆E5R – E5-Flag a été généré en insérant la séquence E5R-Flag dans le locus TK de MVA∆E5R. MVA∆E5R-E5R95K-Flag a été généré en insérant la séquence E5R-Flag dans le locus TK de MVA∆E5R en utilisant la sélection de médicaments. Le virus recombinant a été enrichi en présence d'un milieu de sélection gpt, comprenant du MPA, de la xanthine et de l'hypoxanthine, et la plaque a été purifiée pendant au moins quatre cycles. Au cours du processus de sélection, une mutation spontanée s'est produite, entraînant la génération de MVA∆E5R-E5R95K-Flag, vérifiée par PCR et séquençage d'ADN. Les virus de la vaccine recombinants ont été vérifiés par PCR de l'ADN viral génomique (Fig. 7 supplémentaire).

Des souris C57BL/6J femelles âgées de 6 à 8 semaines (5 à 10 dans chaque groupe) ont été anesthésiées et infectées par voie intranasale avec WT VACV, VACV∆E5R ou VACV∆E5 exprimant le révertant pleine longueur E5R et divers mutants de troncature E5R aux doses indiquées dans 20 µl de PBS. Les souris ont été surveillées et pesées quotidiennement. Ceux qui ont perdu plus de 30 % de leur poids initial ont été euthanasiés. Les courbes de survie de Kaplan-Meier ont été déterminées. Le liquide de lavage bronchoalvéolaire (BALF) a été récolté après une perfusion intratrachéale de 1 ml de PBS froid. Pour mesurer les titres viraux dans différents organes, les poumons, les foies et les rates ont été récoltés, placés dans des tubes avec 1 ml de PBS et homogénéisés à l'aide du dissociateur Miltenyi GentleMACS. Les suspensions cellulaires ont subi trois cycles de congélation-décongélation et ont été soniquées avant titrage sur des cellules BSC40. Le sang a été recueilli dans des tubes Eppendorf de 1,5 ml et le sérum a été conservé après centrifugation. Les titres de virus ont été déterminés en calculant le nombre de plaques (pfu) par gramme de tissus (pfu/g).

BSC40 a été infecté par WT VACV ou VACV∆E5R à un MOI de 0,05. Les cellules ont ensuite été grattées dans le milieu et collectées aux moments indiqués. Après trois cycles de congélation-décongélation et de sonication ultérieure, les titres viraux dans les échantillons collectés ont été déterminés par dosage de plaque sur des cellules BSC40.

Des souris femelles C57BL/6J âgées de 6 à 8 semaines ont été vaccinées par injection SS ou ID avec MVA-OVA ou MVA∆E5R-OVA à une dose de 2 × 107 pfu. Une semaine plus tard, les rates et les ganglions lymphatiques drainants (dLN) ont été prélevés et traités à l'aide du dissociateur Miltenyi GentleMACS™. Les splénocytes ont été stimulés avec le peptide OVA257–264 (SIINFEKL) (5 μg/mL). Après 1 h de stimulation, GolgiPlug (BD Biosciences) (dilution 1:1000) a été ajouté et incubé pendant 12 h. Les cellules ont ensuite été traitées avec le kit BD Cytofix/Cytoperm™ avant la coloration avec les anticorps respectifs pour les analyses de cytométrie en flux. Les anticorps utilisés pour ce dosage sont les suivants : BioLegend : CD3e (145-2C11), CD4 (GK1.5), CD8 (53-5.8), IFN-γ (XMG1.2).

Les dLN ont été digérés avec de la collagénase D (2,5 mg/mL) et de la DNase (50 µg/mL) à 37 °C pendant 25 min avant de filtrer à travers un tamis cellulaire de 70 µm. Pour la coloration tétramère, les cellules ont été incubées avec des tétramères pendant 30 min à 37 ° C. Le tétramère Alexa Fluor 647 H-2K(b) ova 257-264 SIINFEKL et le tétramère PE IA(b) Ova 329-337 AAHAEINEA ont été synthétisés à partir du NIH Tetramer Core Facility. Les cellules ont été analysées sur le BD LSRFortessa.

BSC40, HEK293T et MEF ont été cultivés dans le milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (Corning, Cat # 10-014-CV) complété avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), 2 mM de l-glutamine et 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine. BHK-21 a été cultivé dans le milieu essentiel minimal d'Eagle (Eagle's MEM, Life Technologies, Cat # 11095-080) contenant 10 % de FBS, avec 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine. Pour la génération de GM-CSF-BMDC, des cellules de moelle osseuse (5 millions de cellules dans chaque boîte de culture cellulaire de 15 cm) ont été cultivées dans du milieu RPMI-1640 additionné de 10 % de FBS en présence de GM-CSF (20 ng/mL, BioLegend, Cat# 576304) pendant 9 à 12 jours comme décrit précédemment43. Pour la génération de macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMM), des cellules de moelle osseuse ont été cultivées dans un milieu RPMI-1640 additionné de 10 % de FBS en présence de M-CSF (10 ng/mL, PeproTech, Cat# 315-02) pendant 7 à 9 jours.

Génération de fibroblastes dermiques de la peau : les feuilles épidermiques de souris ont été retirées comme décrit précédemment69. En bref, les peaux ont été lavées avec du PBS froid sans Ca2+ et Mg2+, puis incubées dans un tampon de digestion contenant 1 U de dispase/mL à 37 °C pendant 1 h. Les feuilles épidermiques ont été retirées mécaniquement et le derme restant a été lavé 5 fois dans du PBS sans Ca2+ et Mg2+ et incubé dans un tampon de digestion contenant 2 mg/mL de collagénase A (Roche), 100 µg/mL de DNase I (Sigma, d4527) et 1 % de BSA dans du PBS sans Ca2+ et Mg2+ à 37 °C pendant 1 à 2 h. La suspension résultante a été filtrée séquentiellement à travers une maille en nylon de 100, 70 et 40 mm (VWR) et lavée deux fois avec un tampon (PBS sans Ca2+ et Mg2+ contenant 1 % de BSA et 2 mM d'EDTA). Les cellules ont été cultivées dans du milieu RPMI-1640 additionné de 10 % de FBS. Seules les cellules adhérentes ont été utilisées après 2 à 3 jours de culture.

Les niveaux d'IFN-β dans le BALF ont été déterminés à l'aide d'un kit IFN bêta ProQuantum Immunoassay de souris (ThermoFisher). Les niveaux d'IFN-α et d'IFN-β dans les surnageants de BMDC cultivées ont été déterminés par ELISA (PBL Biomedical Laboratories).

Les GM-CSF-BMDC de souris WT ou cGAS − / − ont été infectés par MVA-OVA ou MVA∆E5R-OVA à un MOI de 10 pendant 16 h. Les cellules ont été lavées avec du tampon MACS (Miltenyi Biotec) et colorées avec des anticorps contre CD40 (3/23, Biolegend) et CD86 (GL-1, Biolegend). Les analyses FACS ont été effectuées à l'aide de l'analyseur de cellules LSRFortessaTM (BD Biosciences). Les données ont été collectées avec FACSDiva 8.0 et analysées avec le logiciel FlowJo (version 10.5.3).

Les cellules cultivées ont été étalées sur une lame de chambre Lab-TekTM II (ThermoFisher) et fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % (p/v) à température ambiante (RT) pendant 10 min, perméabilisées avec du Triton X-100 à 0,5 % (v/v) dans du PBS pendant 5 min et bloquées dans du sérum de chèvre à 5 % (Sigma), de l'albumine de sérum bovin à 3 % (Fisher) et du Triton X-100 à 0,1 % à température ambiante pendant 1 h. Les anticorps primaires ont été incubés à 4 ° C aux dilutions indiquées pendant une nuit : souris anti-Flag (1: 1000, Sigma) et anti-cGAS (1: 1000, Abcam). Après trois lavages dans du PBS, les lames ont été incubées avec les anticorps secondaires indiqués, y compris la chèvre anti-souris Alexa Fluor-647 (1:1000, Invitrogen) et la chèvre anti-lapin Alexa Fluor-488 (1:1000, Invitrogen) à température ambiante pendant 60 min. Après trois lavages dans du PBS, les lames ont été montées dans du ProLong Gold Antifade Mountant (ThermoFisher). Les images ont été acquises à l'aide d'un microscope confocal (Leica TCS SP8 ou Zeiss LSM880).

Pour l'imagerie accélérée du virisome dans les MEF, les cellules ont été ensemencées sur une lame de chambre Lab-TekTM II (ThermoFisher), infectées avec MVA∆E5R à MOI 10 et colorées avec de l'ADN-SiR fluorogène (Cytoskeleton). Les cellules ont été incubées à 37 °C additionnées de 5 % de CO2. Les images ont été acquises à l'aide d'un ZEISS Axio Observer Z1. Toutes les images ont ensuite été traitées avec le logiciel Image J.

Le plasmide rapporteur IFN-β (pIFN-β-luc)70 a été fourni par Michaela Gack (Université de Chicago). pRL-TK a été acheté chez Promega. Le plasmide d'expression STING humain a été fourni par Tom Maniatis (Université de Columbia). Les séquences murines STING (mSTING) ont été amplifiées par PCR et ont été clonées dans des plasmides pcDNA3.2-DEST. Les plasmides cGAS humain (hcGAS) et murin cGAS (mcGAS) ont été achetés chez Invivogen. V5 – cGAS ont été amplifiés par PCR et clonés dans des plasmides pcDNA3.2-DEST. pRK-HA-Ubiquitine-WT, pRK-HA-Ubiquitine-K48 et pBabe 12S E1A ont été achetés chez Addgene. Quatre-vingts gènes VACV sélectionnés ont été amplifiés par PCR à partir du génome VACV WR et sous-clonés dans pcDNA3.2-DEST en utilisant la méthode de clonage Gateway (Invitrogen). Les gènes E1A marqués par drapeau et VACV marqués par drapeau ont été amplifiés par PCR et sous-clonés dans pcDNA3.2-DEST en utilisant la méthode de clonage Gateway (Invitrogen). VACV E5R (aa : 55-341) a été amplifié par PCR à partir du génome VACV WR et sous-cloné dans pcDNA3.1 et pQCXIP.

Les cellules HEK293T ont été passées dans une plaque à 6 puits. Le lendemain, les cellules ont été transfectées avec trois plasmides - VSVG, gag / pol et pQCXIP-E5R ou pQCXIP avec de la lipofectamine 2000. Après 2 jours, les surnageants cellulaires ont été collectés et filtrés à travers un filtre de 0, 45 μm et stockés à -80 ° C.

Les activités luciole et Renilla luciférase ont été mesurées à l'aide du système Dual-Luciferase Reporter Assay selon les instructions du fabricant (Promega). Pour dépister les inhibiteurs de la vaccine de la voie cGAS/STING, les plasmides d'expression cGAS (50 ng) et STING (10 ng), ainsi que pIFN-β-luc (50 ng), pRL-TK (10 ng), ainsi que le plasmide d'expression du gène de la vaccine sélectionné ou le plasmide d'expression de l'adénovirus E1A (200 ng) ont été transfectés dans des cellules HEK293T. Vingt-quatre heures après la transfection, les cellules ont été collectées et lysées. Pour évaluer les effets des inhibiteurs de la vaccine de la voie STING, le plasmide d'expression STING (50 ng), ainsi que pIFN-β-luc (50 ng), pRL-TK (10 ng), ainsi que l'expression du gène de la vaccine sélectionné, les constructions ou le plasmide d'expression de l'adénovirus E1A (200 ng) ont été transfectés dans des cellules HEK293T. L'activité relative de la luciférase a été exprimée en unités arbitraires en normalisant l'activité de la luciférase de luciole sous le promoteur IFNB à l'activité de la luciférase de Renilla à partir d'un plasmide témoin, pRL-TK.

Les cellules ont été lysées dans un tampon de lyse RIPA additionné de 1 x Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (ThermoFisher). Pour extraire les protéines cytoplasmiques et nucléaires, les cellules ont été traitées avec le kit d'extraction nucléaire et cytoplasmique NE-PER (ThermoFisher, 78833). Les échantillons de protéines ont été séparés par SDS-PAGE puis transférés sur membrane de nitrocellulose et incubés avec des anticorps primaires spécifiques pour cGAS (CST, 31659), STING (CST, 13647), FLAG (Sigma, F3165), HA (Sigma, H3663), V5 (ThermoFisher, R960-25), mCherry (ThermoFisher, M11217), β-actine (Sigma , A2228), Lamin B1 (Sigma, ZRB1143) et GAPDH (CST, 2118) ont été utilisés. L'anticorps C7 a été produit dans notre laboratoire et décrit auparavant24. L'anticorps E3 a été gracieusement fourni par le Dr Stuart N. Isaacs (Université de Pennsylvanie)71. Des anticorps anti-IgG de lapin, de souris ou de rat conjugués à la HRP ont été utilisés comme anticorps secondaires (CST, 7074, 7076 ou 7077). La détection a été réalisée à l'aide de substrats SuperSignalTM (Thermo Fisher, 34577 ou 34095).

Pour détecter la protéine cGAS ubiquitinée pendant l'infection par le virus de la vaccine, les BMDC ont été infectés par le MVA à MOI 10 pendant 6 h en présence de MG132 (25 μg/mL). Les protéines ubiquitinées ont été purifiées à l'aide de Halo-4 × UBAUBQLN1 comme décrit précédemment40. En bref, des extraits de cellules entières (1 mg) ont été lysés dans un tampon de lyse contenant 100 mM de chloroacétamide et incubés à 4 ° C pendant 16 h avec 30 μL de billes Halo-4 × UBAUBQLN1 (volume du pack). Après quatre lavages avec un tampon de lyse contenant du NaCl 1 M et un lavage final dans du Tris 10 mM (pH 8,0), les protéines ont été libérées de Halo-4xUBAUBQLN1 en utilisant un tampon d'échantillon avant l'analyse par SDS-PAGE. Pour la co-transfection cGAS et E5R, des cellules HEK293T dans des plaques de 10 cm ont été transfectées avec V5 – cGAS avec E5R-Flag ou pcDNA3.1. 24 h plus tard, les cellules ont été traitées avec MG132 (25 μg/mL) pendant 6 h avant de lyser dans du tampon de lyse.

Pour les tests d'ubiquitination cGAS, des cellules HEK293T dans des plaques de 10 cm ont été transfectées avec V5 – cGAS avec HA-Ub-WT ou HA-Ub-K48. 24 h plus tard, les cellules ont été infectées avec MVA ou MVA∆E5R à MOI 10 pendant 6 h en présence de MG132 (25 μg/mL) et lysées dans du tampon de lyse RIPA (ThermoFisher, 89901) sur de la glace pendant 30 min. L'anticorps anti-V5 (ThermoFisher, R960-25) a été ajouté au lysat cellulaire à une concentration finale de 1 μg/mL et incubé à 4 °C pendant une nuit sur un rotateur. Le lendemain, des billes magnétiques de protéine G (Bio-Rad, 161-4023) ont été ajoutées et incubées à 4 ° C pendant 2 h. Les billes ont été lavées cinq fois avec du tampon RIPA. Enfin, les protéines liées aux billes ont été dénaturées dans un tampon SDS en chauffant à 98 ° C pendant 5 min avant de les charger sur un gel SDS-PAGE.

Pour le test d'interaction cGAS et E5, des cellules HEK293T dans des plaques de 10 cm ont été transfectées avec V5 – cGAS avec E5R-Flag ou pcDNA3.1. Deux jours plus tard, les cellules ont été lysées dans du tampon de lyse Pierce IP sur de la glace pendant 30 min. Les lysats cellulaires ont été traités avec ou sans 250 U/mL de Benzonase (Sigma, E8263) à 4 °C pendant 30 min avant d'être mélangés avec de la protéine G-agarose (ThermoFisher, 20399). Dans les BMDC, les cellules ont été infectées avec MVA∆E5R-E5R-Flag à un MOI de 10 pendant 6 h. Les cellules ont été lysées comme ci-dessus. L'anticorps cGAS (Abcam, ab252416) a été ajouté au lysat cellulaire à une concentration finale de 1 μg/ml et incubé à 4 °C pendant une nuit sur un rotateur. Le lendemain, des billes de protéine G-agarose ont été ajoutées et incubées à 4 °C pendant 2 h. Les billes ont été lavées cinq fois avec un tampon de lyse IP. Enfin, les protéines dans le tampon SDS ont été dénaturées par chauffage à 98 ° C pendant 5 min avant d'être chargées sur SDS-PAGE.

L'ARN total a été extrait des lysats de cellules entières à l'aide du réactif TRIzol (Invitrogen) ou du kit RNeasy Plus Mini (Qiagen). Les ARN ont été rétrotranscrits et amplifiés par PCR en utilisant le kit de synthèse d'ADNc Verso (Thermo Fisher) et le SYBRTM Green Master Mix (Thermo Fisher). Les ARN cellulaires ont été normalisés aux niveaux de GAPDH. Les niveaux de GAPDH étaient stables dans les BMDC sous infection virale43. La méthode ΔΔCt a été utilisée pour mesurer l'expression des gènes, et les efficacités des tests qPCR étaient comprises entre 90 % et 110 %72. Tous les tests ont été effectués sur un système ABI 7500 et analysés avec le logiciel ABI 7500 SDS v.1.3 (Applied Biosystems) et suivis MIQE73. La distribution des données a été évaluée avec le test de Shapiro-Wilk. Les séquences d'amorces sont répertoriées dans le tableau S1.

Le cGAMP a été mesuré par LC-MS comme indiqué précédemment74. En bref, les culots cellulaires ont été complétés avec des étalons internes de 80 fmol (15N10-cGAMP, générés en interne) et ont ensuite été extraits dans du méthanol à 80% et de l'acide acétique à 2% et deux fois dans de l'acide acétique à 2% pour obtenir un extrait de métabolite. Le cGAMP a été enrichi à partir d'extraits combinés sur des colonnes HyperSep Aminopropyl SPE (Thermo Scientific). Après lavage deux fois dans de l'acide acétique à 2 % et une fois dans du méthanol à 80 %, les échantillons ont été élues dans de l'hydroxyde d'ammonium à 4 % dans du méthanol à 80 %. Les éluants séchés sous vide ont été dissous dans de l'eau et analysés sur un HPLC Dionex U3000 couplé à un spectromètre de masse TSQ Quantiva Triple Quadruple (Thermo Scientific). La chromatographie a utilisé la résine LUNA NH2 (5 µm, Phenomenex) comme phase stationnaire emballée dans des capillaires de silice de 0,1 mm ID × 70 mm L. Les phases mobiles sont l'acétonitrile (A), le bicarbonate d'ammonium 20 mM et la solution aqueuse d'hydroxyde d'ammonium 20 mM (B). Le débit est de 800 nL/min (0 à 4 min), 300 nL/min (4 à 19 min) et 600 nL/min (19 à 27 min), avec un gradient de 20 % B (0 à 3 min), 50 % B (4 min), 80 % B (14 à 18 min) et 20 % B (19 à 27 min). cGAMP et standard ont été analysés par contrôle de réaction multiple en mode positif avec les transitions suivantes : 675-136, 675-152, 675-476 et 675-524 pour cGAMP ; et 685-136, 685-157, 685-480 et 685-529 pour la norme 15N10-cGAMP. Les niveaux de cGAMP endogènes ont été calculés en multipliant les rapports cGAMP-standard par 80 fmol (la quantité de standard enrichie dans chaque échantillon).

Des BMDC cultivées avec du GM-CSF (1 × 106) provenant de souris WT ou cGAS−/− ont été infectées par le MVA ou le MVA∆E5R à une multiplicité d'infection (MOI) de 10. Les cellules ont été collectées 16 h après l'infection. L'ARN total a été extrait des cellules collectées aux moments indiqués à l'aide du kit RNeasy Plus Mini (Qiagen) conformément au protocole du fabricant, y compris le traitement à la DNase I. L'intégrité totale de l'ARN a été analysée à l'aide d'un bioanalyseur 2100 (Agilent Technologies). L'ARN messager a été préparé à l'aide du kit de préparation de bibliothèque d'échantillons d'ARNm Stranded TruSeq (Illumina, San Diego, CA) conformément aux instructions du fabricant. Les bibliothèques d'ADNc finales normalisées ont été regroupées et séquencées sur un séquenceur Illumina NovaSeq6000 avec des cycles de 50 paires. Les lectures de séquençage brut au format BCL ont été traitées via bcl2fastq 2.19 (Illumina) pour la conversion et le démultiplexage FASTQ. Après avoir coupé les adaptateurs avec cutadapt (version 1.18), les lectures d'ARN ont été alignées et cartographiées sur le génome de référence humain GRCh38 par STAR (version 2.5.2), et la reconstruction du transcriptome a été réalisée par Cufflinks (version 2.1.1). L'abondance des transcrits a été mesurée avec des boutons de manchette en fragments par kilobase du modèle d'exon par million de lectures cartographiées (FPKM). Des profils d'expression génique ont été construits pour l'expression différentielle, les clusters et les analyses de composants principaux avec le package DESeq2. Le logiciel GSEA du Broad Institute a été utilisé pour identifier les fonctions des gènes exprimés de manière différentielle. Les gènes ont été classés par la valeur log2 FC obtenue à partir de l'analyse de l'expression différentielle, et la version pré-classée de l'outil a été utilisée pour identifier les voies biologiques considérablement enrichies. Des cartes thermiques de voies biologiques considérablement enrichies ont été générées avec le package R pheatmap (https://www.rdocumentation.org/packages/phheatmap/versions/1.0.12/topics/phheatmap).

Des parcelles de volcan ont été générées avec le package R EnhancedVolcano (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/EnhancedVolcano.html).

Les données RNA-Seq pour ce projet ont été déposées dans Gene Expression Omnibus du NCBI, numéro d'accession GSE185431.

Le test t de Student non apparié à deux queues a été utilisé pour les comparaisons de deux groupes dans les études. Les données de survie ont été analysées par le test du log-rank (Mantel-Cox). Les valeurs de p jugées significatives sont indiquées sur les figures comme suit : *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001 ; ****p < 0,0001. Le nombre d'animaux inclus dans l'étude est discuté dans la légende de chaque figure.

Tous les matériaux uniques sont facilement disponibles auprès des auteurs correspondants sur demande. La disponibilité de l'anticorps reconnaissant la protéine C7 du VACV est limitée.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données RNAseq ont été déposées dans le Gene Expression Omnibus (GEO) sous le numéro d'accession GSE185431. Toutes les autres données étayant les conclusions de cette étude sont disponibles dans l'article et ses fiches d'informations complémentaires. Les données sources sont fournies dans ce document.

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Nous remercions le Flow Cytometry Core Facility et le Molecular Cytology Core Facility du Sloan Kettering Institute. Nous remercions les Drs. Charles Rice et Stewart Shuman pour des discussions utiles. Ce travail a été soutenu par les subventions du NIH K-08 AI073736 (LD), R56AI095692 (LD), R03 AR068118 (LD), R35 GM132111 (HF) et MSK Technology Development Fund (LD), accord de recherche parrainé par IMVAQ Therapeutics (LD) et Cancer Prevention and Research Institute of Texas, RP180725 (ZJC). ZJC est chercheur au Howard Hughes Medical Institute. Cette recherche a également été financée en partie par le NIH/NCI Cancer Center Support Grant P30 CA008748.

Christian Zierhut

Adresse actuelle : The Institute of Cancer Research, Londres, SW3 6JB, Royaume-Uni

Service de dermatologie, Département de médecine, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, NY, 10065, États-Unis

Ning Yang, Yi Wang, Peihong Dai et Liang Deng

Département de biologie moléculaire, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, 75390, États-Unis

Tuo Li et Zhijian Chen

Laboratoire de biologie des chromosomes et des cellules, Université Rockefeller, New York, NY, 10065, États-Unis

Christian Zierhut & Hironori Funabiki

Centre de ressources génomiques, Weill Cornell Medical College, New York, NY, 10065, États-Unis

Adrian Tan, Tuo Zhang et Jenny Zhaoying Xiang

Programme de biologie cellulaire, Sloan Kettering Institute, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, NY, 10065, États-Unis

Alban Ordureau

Programme d'oncologie humaine et de pathogenèse, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, NY, 10065, États-Unis

Liang Deng

Weill Cornell Medical College, New York, NY, 10065, États-Unis

Liang Deng

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Contributions des auteurs : NY et LD ont été impliqués dans tous les aspects de cette étude, y compris la conception du projet, la conception et la réalisation d'expériences, l'analyse et l'interprétation des données et la rédaction d'articles. NY a conçu le crible pour les inhibiteurs de la vaccine de la voie de détection de l'ADN cytosolique et a réalisé la plupart des expériences. YW a aidé NY dans le criblage et la validation des inhibiteurs de la vaccine. YW et LD ont réalisé des expériences RNA-seq. YW et LD ont généré divers virus de délétion VACV E5 et réalisé des études de pathogenèse. PD et TL sont impliqués dans la mesure de cGAMP dans les BMDC infectés par la vaccine et le MVA. AT, TZ et JZX ont analysé les données d'ARN-seq et ont aidé à la préparation du manuscrit. CZ, HF, AO et ZJC ont participé à la conception expérimentale, à l'interprétation des données et à la préparation du manuscrit. LD a assuré la supervision globale du projet.

Correspondance avec Ning Yang ou Liang Deng.

Le Memorial Sloan Kettering Cancer Center a déposé une demande de brevet pour la découverte d'inhibiteurs viraux de la vaccine de la voie de détection de l'ADN cytosolique et son utilisation pour améliorer le MVA et la vaccine en tant qu'agents oncolytiques et vecteurs de vaccins. Le brevet a été concédé sous licence à IMVAQ Therapeutics. LD et NY sont co-fondateurs d'IMVAQ Therapeutics. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie François Meurens, Luis Sigal, et le(s) autre(s) relecteur(s) anonyme(s) pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Yang, N., Wang, Y., Dai, P. et al. Vaccinia E5 est un inhibiteur majeur du capteur d'ADN cGAS. Nat Commun 14, 2898 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38514-5

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Reçu : 02 juin 2022

Accepté : 05 mai 2023

Publié: 22 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-38514-5

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