Le nitazoxanide inhibe le KLF5 acétylé

BMC Medicine volume 21, Numéro d'article : 68 (2023) Citer cet article

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Le cancer de la prostate résistant à la castration forme souvent des métastases osseuses, et ces métastases osseuses finissent par devenir résistantes aux thérapies disponibles, entraînant la mort des patients. Enrichi dans l'os, le TGF-β joue un rôle central dans le développement des métastases osseuses. Cependant, cibler directement le TGF-β ou ses récepteurs a été difficile pour le traitement des métastases osseuses. Nous avons précédemment découvert que le TGF-β induit puis dépend de l'acétylation du facteur de transcription KLF5 à K369 pour réguler plusieurs processus biologiques, notamment l'induction de l'EMT, l'invasivité cellulaire et les métastases osseuses. Le KLF5 acétylé (Ac-KLF5) et ses effecteurs en aval sont donc des cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement des métastases osseuses induites par le TGF-β dans le cancer de la prostate.

Un test d'invasion sphéroïde a été appliqué aux cellules cancéreuses de la prostate exprimant KLF5K369Q, qui imite Ac-KLF5, pour dépister les médicaments approuvés par la FDA en 1987 pour la suppression de l'invasion. Des cellules exprimant la luciférase et KLF5K369Q ont été injectées à des souris nude via l'artère caudale pour modéliser la métastase osseuse. Imagerie de bioluminescence, micro-CT) et des analyses histologiques ont été appliquées pour surveiller et évaluer les métastases osseuses. Des analyses de séquençage d'ARN, bioinformatiques et biochimiques ont été utilisées pour comprendre les gènes régulés par le nitazoxanide (NTZ), les voies de signalisation et les mécanismes sous-jacents. La liaison de NTZ aux protéines KLF5 a été évaluée à l'aide d'un titrage par fluorescence, d'une chromatographie liquide à haute performance (HPLC) et d'une analyse de dichroïsme circulaire (CD).

La NTZ, un agent anthelminthique, a été identifiée comme un puissant inhibiteur d'invasion dans les essais de dépistage et de validation. Dans les métastases osseuses induites par KLF5K369Q, la NTZ a exercé un puissant effet inhibiteur en mode préventif et thérapeutique. NTZ a également inhibé la différenciation des ostéoclastes, un processus cellulaire responsable des métastases osseuses induites par KLF5K369Q. NTZ a atténué la fonction de KLF5K369Q dans la régulation à la hausse de 127 gènes et la régulation à la baisse de 114 gènes. Les modifications de l'expression de certains gènes étaient significativement associées à une survie globale plus faible chez les patients atteints d'un cancer de la prostate. L'un de ces changements a été la régulation à la hausse de MYBL2, qui favorise fonctionnellement les métastases osseuses dans le cancer de la prostate. Des analyses supplémentaires ont démontré que NTZ se liait à la protéine KLF5, KLF5K369Q se liait au promoteur de MYBL2 pour activer sa transcription, et NTZ atténuait la liaison de KLF5K369Q au promoteur MYBL2.

La NTZ est un agent thérapeutique potentiel pour les métastases osseuses induites par l'axe de signalisation TGF-β/Ac-KLF5 dans le cancer de la prostate et probablement d'autres cancers.

Rapports d'examen par les pairs

Le cancer de la prostate (PCa) est l'une des principales causes de mortalité par cancer chez l'homme [1]. Au stade initial de l'APC, les tumeurs localisées peuvent être traitées avec succès par chirurgie ou radiothérapie, mais environ 20 à 30 % des patients rechuteront [2]. Bien que les patients en rechute soient généralement initialement sensibles au traitement par privation androgénique, ils développeront éventuellement un cancer de la prostate résistant à la castration (CRPC) [3]. La plupart des CPRC métastasent et environ 90 % d'entre eux métastasent aux os [4, 5]. Semblables aux métastases osseuses d'autres tumeurs malignes, les métastases du CPRC dans l'os répondent initialement aux thérapies ciblées telles que les taxanes. Pourtant, pratiquement tous développent une résistance au traitement et deviennent incurables. Pour les métastases osseuses résistantes aux médicaments, les traitements disponibles tels que le dénosumab, l'acide zolédronique et les bisphosphonates ne peuvent que soulager les symptômes ou la morbidité et prévenir ou retarder les événements osseux (SRE). De tels traitements n'améliorent pas significativement la survie globale des patients [6, 7]. Par conséquent, il est urgent de développer de nouvelles thérapies efficaces contre les métastases osseuses résistantes aux médicaments pour le cancer de la prostate et d'autres types de tumeurs malignes qui développent des métastases osseuses, notamment le cancer du sein, le cancer du poumon et le myélome multiple.

Le milieu osseux est riche en TGF-β (transforming growth factor-β), une cytokine régulant divers processus physiologiques et pathologiques. Le TGF-β joue un rôle central dans le développement des métastases osseuses, même s'il supprime la prolifération cellulaire et la croissance tumorale aux premiers stades de la tumorigenèse [8,9,10,11]. Bien que la signalisation du TGF-β soit une cible attrayante pour le traitement des métastases osseuses, le ciblage direct du TGF-β et de ses récepteurs s'est avéré difficile pour différentes raisons [12, 13, 14]. Par exemple, le TGF-β a des fonctions essentielles dans l'homéostasie tissulaire [14], et les composés ciblant le TGF-β ne sont souvent pas sélectifs et peuvent donc entraîner des toxicités pour les tissus cardiaques et la peau [15, 16].

Nos études précédentes ont démontré que, dans les cellules épithéliales, le TGF-β induit l'acétylation du facteur de transcription KLF5 (Krüppel-like factor 5) en lysine 369 (K369) [17, 18]. Par la suite, le TGF-β et le KLF5 acétylé (Ac-KLF5) forment un axe de signalisation pour réguler la transcription des gènes et divers processus cellulaires tels que la prolifération cellulaire, la motilité et l'invasion cellulaires et la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) [17,18,19, 20,21]. Plus récemment, nous avons découvert que l'axe TGF-β/Ac-KLF5 induit également des métastases osseuses et une résistance aux médicaments dans le cancer de la prostate [22, 23]. Il est important de noter que les métastases du cancer de la prostate provenant de l'environnement osseux riche en TGF-β expriment en effet des niveaux plus élevés d'Ac-KLF5 que celles des tissus viscéraux [23]. Le fait que le TGF-β et l'Ac-KLF5 forment un axe et que l'Ac-KLF5 est essentiel pour que le TGF-β induise des métastases osseuses suggère que l'Ac-KLF5 et ses effecteurs en aval sont des cibles thérapeutiques alternatives pour le traitement de la maladie induite par le TGF-β. métastase osseuse dans PCa.

Dans cette étude, nous avons adopté un test de dépistage d'invasion sphéroïde in vitro sur des cellules cancéreuses de la prostate exprimant KLF5K369Q, un mutant imitant Ac-KLF5 [22, 23]. À l'aide du système, nous avons examiné 1987 médicaments approuvés par la FDA pour identifier les médicaments qui inhibent l'invasion cellulaire et les métastases osseuses. Ici, nous décrivons les résultats du dépistage et présentons des données selon lesquelles un médicament anthelminthique-nitazoxanide (NTZ), en tant qu'inhibiteur puissant des métastases osseuses dans un modèle murin. Nous présentons également des données cellulaires et moléculaires qui soutiennent l'effet inhibiteur de NTZ sur les métastases osseuses et fournissent des mécanismes sur la façon dont NTZ agit pour supprimer les métastases osseuses.

La bibliothèque de médicaments approuvée par la FDA mini (Cat #: HY-L022M), qui contenait 1987 médicaments dans des plaques à 96 puits et dissous dans 10 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO) à 10 mM, a été achetée auprès de MedChemExpress (Shanghai, Chine). Du nitazoxanide supplémentaire (Cat #: HY-B0217) a été acheté auprès de MedChemExpress et dissous dans du DMSO à une concentration de 100 mM.

Nous avons précédemment établi des lignées cellulaires PCa humaines stables PC-3 et DU 145 qui expriment le KLF5 de type sauvage, le mutant imitant l'Ac-KLF5 KLF5K369Q (KQ), le mutant déficient en acétylation KLF5K369R (KR) et le contrôle du vecteur pLHCX. [22]. Les cellules PC-3 exprimant différentes formes de KLF5, y compris PC-3-KLF5, PC-3-KQ, PC-3-KR et PC-3-pLHCX, ont été maintenues dans un milieu RPMI-1640 additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (FBS, Biological Industries, HAMEK, Israël) et pénicilline/streptomycine à 1 % (100 U/mL, Biological Industries). Des cellules DU 145 exprimant différentes formes de KLF5 ont été cultivées dans le milieu minimum d'Eagle (MEM) (Corning, New York, USA) avec 10% de FBS.

Les cellules PC-3-KLF5, PC-3-KQ et PC-3-KR ont été infectées par des lentivirus exprimant la luciférase (HBLV-LUC-PURO, Hanbio, Shanghai, Chine). Les cellules infectées ont été sélectionnées pour des populations cellulaires stables dans un milieu contenant de la puromycine (2 μg/mL).

La lignée cellulaire de macrophages RAW264.7 a été obtenue auprès de l'American Type Cell Culture (ATCC, Manassas, VA, USA) et cultivée dans du milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) (Biological Industries) additionné de 10% de FBS. Toutes les cellules ont été cultivées à 37°C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO2.

Des cellules PC-3 exprimant différentes formes de KLF5 ont été mises en suspension dans un milieu sans sérum et ensemencées dans la chambre supérieure d'un dispositif trans-puits (Cat #: 353097, Corning) à 5 × 104 cellules par puits. Sept cent cinquante μL de milieu complet contenant 15 % de FBS ont été ajoutés à la chambre inférieure. Quarante-huit heures plus tard, les cellules de la face supérieure de la membrane ont été grattées à l'aide d'un tampon de coton, tandis que les cellules de la face inférieure ont été colorées avec du cristal violet (Cat # : C0121, Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine) et photographiées à l'aide d'un stéréoscope. (Mshot, Canton, Chine). La membrane a ensuite été placée dans 500 μL d'acide acétique à 33 % dans la chambre inférieure pour dissoudre les cellules. Les densités optiques des cellules dissoutes ont été mesurées à l'aide d'un lecteur de microplaques (BioTek, Winooski, Vermont, USA) à 570 nm.

Le test d'invasion a été réalisé comme décrit précédemment [24]. En bref, des cellules PC-3-KQ à 80-90% de confluence ont été étalées sur des plaques à fond rond de 384 puits avec une fixation ultra-faible (Cat #: 4516, Corning) à 500 cellules par puits dans un milieu de 80 μL. Les plaques ont ensuite été centrifugées à 320 g pendant 4 min pour regrouper les cellules au fond des puits et incubées pendant 3 jours. Le quatrième jour, 40 μL de milieu ont été retirés de chaque puits, 40 μL du mélange matrigel-milieu ont été ajoutés à chaque puits et les cellules ont été cultivées pendant 3 jours supplémentaires. Le matrigel (Cat # : 354234, Corning) provenait de Corning et le milieu contenait 1 % de FBS. À la fin de l'incubation, des images ont été prises à l'aide d'un microscope à contraste de phase (Eclipse Ti2, Nikon, Tokyo, Japon) avec des lentilles d'objet 10 ×, et la surface totale des cellules et la surface de la sphère centrale des cellules (Fig. 1a) ont été mesuré à l'aide du logiciel Image J. La zone d'invasion a été calculée à l'aide de la formule suivante : zone d'invasion = surface totale des cellules - surface de la sphère centrale [25].

Dépistage des médicaments approuvés par la FDA pour ceux qui inhibent l'invasion cellulaire induite par le KLF5 acétylé. a Schéma du flux de travail de dépistage. b Effets inhibiteurs des médicaments approuvés par la FDA en 1987, ainsi que du contrôle du véhicule (points verts pointés par des flèches vertes), sur l'invasion des cellules PC-3-KQ, analysés à l'aide du test d'invasion sphéroïde 3D. Chaque point représente un médicament ou un contrôle, et les points sont alignés le long de l'axe X. L'axe Y indique la zone d'invasion moyenne entre deux puits pour chaque médicament. La ligne horizontale bleue indique la zone d'invasion moyenne de tous les médicaments et contrôles, tandis que la ligne horizontale rouge indique 50 % de la zone d'invasion moyenne. c Proportions des médicaments de 1987 qui sont approuvés comme médicaments non oncologiques (couleur violette), médicaments thérapeutiques ciblés oncologiques (couleur orange) et médicaments chimiothérapeutiques oncologiques (couleur rouge). d Identification des 25 médicaments les plus efficaces en utilisant le test d'invasion de sphéroïdes 3D avec plusieurs concentrations (μM). La carte thermique montre les taux d'invasion (%) des concentrations multiples de chaque médicament par rapport au contrôle du véhicule, comme indiqué par des grilles bleues avec des intensités variables. Les noms des 25 médicaments sont indiqués en bas, avec 6 des plus efficaces marqués par des cases rouges. e La structure chimique du nitazoxanide

Pour le dépistage des médicaments, des médicaments ont été ajoutés au mélange matrigel-milieu lors du remplacement du milieu de culture au jour 4. Pour le premier cycle de dépistage, une concentration finale de 10 μM a été utilisée pour tous les médicaments. Plusieurs concentrations de médicament ont été utilisées pour le deuxième cycle de dépistage, notamment 0, 0,001, 0,01, 0,1, 1 et 10 μM. Des puits en double ont été répétés pour chaque concentration.

Selon les instructions du fabricant, la viabilité cellulaire a été mesurée à l'aide d'un kit de Beyotime Biotechnology. En bref, les cellules ont été ensemencées sur des plaques à 96 puits à 5 × 103 cellules par puits, incubées pendant une nuit, puis traitées pendant 48 h avec des médicaments à 0, 0,02, 0,05, 0,14, 0,41, 1,23, 3,7, 11,1, 33,3 et 100 μM. Quatre médicaments ont été analysés : la furagine, le nifuratel, le nitazoxanide et la rétapamuline. À la fin du traitement médicamenteux, le milieu a été retiré, la solution de CCK-8 a été ajoutée dans chaque puits à 100 μL/puits et incubée pendant 1,5 h à 37 °C, et la densité optique (DO) a été mesurée à 450 nm en utilisant un lecteur de microplaques (BioTek).

Nous avons également testé une gamme plus large de concentrations de NTZ dans les cellules PC-3-KQ et DU 145-KQ à l'aide du test CCK-8 en ensemençant 2 × 103 cellules et 2, 5 × 103 cellules sur chaque puits de plaques à 96 puits. Les cellules PC-3-KQ ont été traitées avec NTZ à 0, 0,01, 0,1, 1,25, 2,5 et 5 μM, tandis que les cellules DU 145-KQ ont été traitées avec NTZ à 0, 0,01, 0,1, 5, 10 et 20 μM pendant 0, 24, 48 et 72 h. Le nombre de cellules viables a été déterminé en utilisant la solution CCK-8 comme décrit ci-dessus.

Les cellules PC-3-KQ et DU 145-KQ ont été ensemencées sur des plaques à 6 puits à raison de 1 × 103 cellules/puits. Après incubation pendant 24 h, les cellules PC-3-KQ ont été traitées avec du NTZ à 0, 1,25, 2,5 et 5 μM, tandis que les cellules DU 145-KQ ont été traitées avec du NTZ à 0, 5, 10 et 20 μM pendant 8 jours . Le milieu contenant le médicament a été remplacé tous les 2 jours. Le 8ème jour, les cellules ont été rincées avec du PBS froid, fixées avec du paraformaldéhyde à 4% pendant 10 min, colorées avec du cristal violet pendant 10 min et photographiées, et les images ont été analysées à l'aide du logiciel Image J.

Des souris nues Balb/c mâles âgées de 3 à 4 semaines ont été achetées à Charles River (Pékin, Chine). À leur arrivée au Animal Center de la Southern University of Science and Technology (SUSTech), les souris ont été mises en quarantaine pendant une semaine avant utilisation. Toutes les souris ont été entretenues et manipulées conformément au guide des National Institutes of Health pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.

Pour mesurer si NTZ inhibe les métastases osseuses induites par Ac-KLF5, nous avons utilisé à la fois les modes de prévention et de thérapie. Pour le modèle de prévention, suivant une méthode récemment publiée [26], des souris ont été anesthésiées, l'artère caudale a été essuyée avec de l'alcool pour dilater le vaisseau sanguin, et 1 × 106 cellules cancéreuses (PC-3-KQ-Luc ou PC-3 -KR-Luc cells) dans 100 μL de PBS ont été injectés dans l'artère caudale en peu de temps (< 3 s) [26]. Ensuite, les souris ont été réparties au hasard en groupes véhicule et NTZ (six souris dans chaque groupe) et ont reçu un traitement au jour 0. La croissance tumorale et le poids corporel ont été déterminés chaque semaine. Après 5 semaines de traitement, toutes les souris ont été sacrifiées et les tissus osseux et les principaux organes ont été réséqués pour la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E). La sélection de 5 semaines pour l'investigation est basée sur l'expérience pilote, dans laquelle des métastases osseuses claires se sont formées 5 semaines après l'injection mais aucune tumeur n'a été détectée dans d'autres organes, y compris le cerveau, le foie, les poumons, la rate, le cœur, la prostate, la vésicule séminale , l'intestin grêle et les testicules (données non présentées).

Pour le modèle de thérapie, 1 × 106 cellules PC-3-KQ-Luc dans 100 μL de PBS ont été injectées dans l'artère caudale de chaque souris comme décrit ci-dessus. Tous les 7 jours, les souris ont été soumises à une imagerie par bioluminescence (BL) et réparties au hasard dans les groupes véhicule et NTZ (n = 6 dans chaque groupe) et ont reçu un traitement au jour 7. La croissance tumorale et le poids corporel ont été mesurés chaque semaine. 35 jours après le traitement final, les tissus osseux de chaque groupe ont été retirés pour une tomodensitométrie à haute résolution (micro-CT), une coloration H&E et une coloration immunohistochimique.

La croissance tumorale dans l'os a été déterminée une fois par semaine par imagerie BL in vivo à l'aide du logiciel Living Image Software 4.4 (IVIS Spectrum, PerkinElmer Health Sciences, Massachusetts, États-Unis). Dix minutes après l'injection intrapéritonéale de sel de sodium de D-luciférine (15 mg/mL, 10 μL/g de poids corporel) (GM-040611, Genomeditech, Shanghai, Chine), des images de bioluminescence ont été acquises dans les conditions suivantes : filtre d'émission ouvert, temps d'exposition = 60 s, binning = moyen : 8, champ de vision = 12,9 × 12,9 cm et f/stop = 1. Les images ont ensuite été analysées à l'aide du logiciel Living Image 4.4 (PerkinElmer). À la fin du traitement, les intensités de bioluminescence ont été mesurées par le flux de photons de la région d'intérêt (ROI) et comparées entre les groupes de traitement véhicule et NTZ.

Pour le traitement médicamenteux, 1% de carboxyméthylcellulose sodique (CMC) (Cat #: CC0113, Leagene Biotechnology, Pékin, Chine) a été utilisé comme véhicule témoin, et NTZ a été résolu dans CMC. La NTZ a été administrée à des souris par voie intragastrique (100 mg/kg de poids corporel) chaque jour.

Après le sacrifice des souris, les membres postérieurs ont été prélevés et fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 48 h. Les membres ont ensuite été scannés à l'aide d'un scanner micro-CT (Skyscan1276, Bruker, Kontich, Belgique). Pour l'imagerie micro-CT, les paramètres de numérisation étaient : tension de source, 60 kV ; courant source, 100 μA ; Filtre IA 0,5 mm ; taille de pixel, 10 μm ; pas de rotation, 0,4 degrés. Les images ont ensuite été traitées et construites à l'aide du logiciel NRecon (Version 1.7.1.6, Bruker) et converties à l'aide de Dataviewer (Version 1.5.4, Bruker). La région d'intérêt (ROI), fixée à 0,5 mm de la plaque de croissance du fémur, a été analysée à l'aide du programme CT-Analyser (CTAn). Les paramètres comprenaient le volume osseux/volume total (BV/TV), le nombre trabéculaire (Tb.N), la séparation trabéculaire (Tb.Sp) et l'épaisseur trabéculaire (Tb.Th). Enfin, les images 3D ont été réalisées dans le logiciel CTvox (Version 2.0, Bruker).

Les fémurs ont été décalcifiés dans une solution de décalcification à l'éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (Cat # : R20403-5L, OKA, Pékin, Chine) pendant 14 à 21 jours. Après décalcification, les tissus osseux ont été déshydratés dans un gradient d'éthanol de 70 à 95 %, trempés dans du n-butanol pendant 6 h, puis inclus dans de la paraffine. Les blocs de tissus ont été coupés en sections de 4 μm. Après cuisson dans un four à 63 ° C pendant 1,5 h, les lames de tissu ont été déparaffinées avec du xylène, hydratées avec un gradient d'éthanol, puis colorées avec H&E (Cat #: BA4025, BaSO, Zhuhai, Chine). Les lames ont ensuite été montées pour analyse avec des résines neutres (Cat #: 25608-33-7, Sigma-Aldrich, MO, USA).

La coloration immunohistochimique a été réalisée en suivant les procédures établies. Brièvement, des coupes de 4 μm de tissus osseux ont été déparaffinées dans du xylène et réhydratées dans un gradient d'éthanol. L'antigène endogène a été récupéré en incubant des lames dans un tampon de citrate de sodium 10 mM (Cat # : C1010, Solarbio, Pékin, Chine) pendant une nuit dans un four à 65°C. Après la récupération de l'antigène, les coupes de tissu ont été incubées avec du peroxyde d'hydrogène à 3 % à température ambiante pendant 10 min pour bloquer l'activité endogène de la catalase. Ils ont ensuite été incubés dans une solution de blocage (0,1 % d'albumine bovine V mélangée à 10 % de sérum de chèvre) pendant 40 min, et une solution contenant un anticorps primaire (MMP9, 1:1000, Cat # : ab76003, Abcam, Cambridge, Royaume-Uni ; MYBL2, 1:100, Cat # : ab76009, Abcam) pendant 1,5 h. Après rinçage au PBS 3 fois, les lames ont été incubées avec la solution d'anticorps secondaire pendant 15 min puis avec la solution DAB en utilisant le kit MaxVision II HRP (Cat #: KIT-5920, MXB Biotechnologies, Fuzhou, Chine). Les noyaux ont été contre-colorés avec de l'hématoxyline pendant 2 min. Les lames ont ensuite été déshydratées avec un gradient d'éthanol (75 à 100%) et de xylène et montées avec des lamelles en utilisant le milieu de montage à durcissement rapide. Toutes les lames ont été numérisées à l'aide d'un système de scanner Aperio VERSA 8 (Leica, Wetzlar, Allemagne) et analysées à l'aide du logiciel Image J (Image J 1.48v, NIH, Bethesda, MD, USA).

Trois systèmes de culture différents ont été utilisés pour le test de différenciation des ostéoclastes in vitro. Dans le premier, les cellules RAW264.7 ont été ensemencées sur des plaques à 96 puits à 1 × 103 cellules/puits et cultivées pendant la nuit. Les cellules ont ensuite été stimulées avec du RANKL de souris recombinant (Cat # : CR06, Novoprotein, Shanghai, Chine) à 50 ng/mL en présence ou en l'absence de diverses concentrations de NTZ (0, 6,25, 12,5, 25 μM). Le milieu a été remplacé tous les 2 jours jusqu'à ce que des ostéoclastes soient observés dans le groupe témoin. Les cellules ont ensuite été fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 min, rincées avec de l'eau déionisée préchauffée et colorées avec de la phosphatase acide tartrate-résistante (TRAP) à l'aide d'un kit de Sigma-Aldrich (Cat # : A387) pour visualiser les ostéoclastes (≥ 3 noyaux/ cellule). L'effet de la NTZ sur la différenciation des ostéoclastes a été déterminé en comptant le nombre de cellules multinucléées à l'aide du logiciel Image J (Image J 1.48v).

Dans le deuxième essai in vitro, nous avons utilisé un milieu conditionné (CM) provenant de cellules exprimant Ac-KLF5 traitées par NTZ. Les cellules PC-3-KQ ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits à raison de 1 × 105 cellules par puits et cultivées pendant la nuit. Les cellules ont été traitées avec du NTZ à 0, 1,25, 2,5 et 5 μM pendant 36 h dans un milieu complet (RPMI1640 avec 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine). Le milieu a été retiré et les cellules ont été lavées deux fois avec le milieu RPMI1640 contenant 0, 5% de FBS et cultivées dans le même milieu pendant encore 12 h. Par la suite, le milieu conditionné (CM) a été collecté à partir de chaque groupe, centrifugé, filtré, aliquoté et stocké à -80°C pour une utilisation ultérieure ou utilisé immédiatement dans les expériences de co-culture. CM de chaque groupe a été mélangé avec le milieu DMEM (10 % FBS) à un rapport de 1:3, et RANKL a été ajouté à une concentration inférieure (10 ng/mL). Les cellules RAW264.7 dans des plaques à 96 puits avec une culture de 24 h ont été incubées avec le milieu contenant CM pendant 7 jours, le milieu étant remplacé tous les 2 jours. Le test de coloration TRAP a été réalisé pour déterminer le nombre d'ostéoclastes différenciés selon les instructions du fabricant.

Le troisième essai in vitro impliquait une co-culture directe entre les cellules RAW264.7 et les cellules cancéreuses. Les cellules RAW264.7 ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à 700 cellules par puits et laissées adhérer pendant 12 h. Des cellules PC-3-KQ ont été ajoutées à chaque puits à raison de 300 cellules/puits et la culture s'est poursuivie pendant 12 h. NTZ a été ajouté pour traiter les cellules pendant 48 h à différentes concentrations finales (0, 1,25, 2,5, 5 μM). Le milieu RAW264.7 a été mélangé avec le milieu PC-3 à 7:3, et le mélange a été utilisé pour remplacer le milieu de culture tous les 2 jours. Après 7 jours, la différenciation des ostéoclastes a été déterminée comme décrit ci-dessus.

La procédure de coloration TRAP dans les tissus a été décrite dans notre étude précédente [23]. En bref, des coupes osseuses déparaffinées et hydratées ont été incubées dans de l'acide acétique 0,2 M pendant 20 min, puis dans de l'acide acétique 0,2 M contenant le sel TR rouge rapide (1,1 mg/mL) et du phosphate de naphtol AS-MX (0,5 mg/mL) pendant environ 45 min à 37°C. Lorsque les cellules TRAP-positives virent au rouge, comme surveillé par microscopie, les lames ont été contre-colorées avec de l'hématoxyline et montées avec des lamelles en utilisant de la glycérine. Les lames ont ensuite été scannées et analysées comme décrit ci-dessus.

Les cellules PC-3-KQ et PC-3-KR ont été ensemencées sur des plaques à 6 puits à 1 × 105 cellules/puits et cultivées pendant 24 h. Le milieu de culture a ensuite été remplacé par celui contenant 0 ou 5 μM de NTZ, et le traitement a duré 48 h. Les cellules ont ensuite été rincées une fois avec du PBS pré-refroidi et collectées dans le réactif TRIzol (Cat #: 15596018, Invitrogen, Carlsbad, Californie, USA). L'extraction d'ARN, la construction de bibliothèques à l'aide du protocole SE100 et le séquençage avec une plate-forme DNBSEQ avec une longueur de séquençage de 100 paires de bases ont été réalisés par le Beijing Genomics Institute (Wuhan, Chine). Le traitement des données brutes a été effectué comme décrit précédemment [14]. Toutes les données d'ARN-seq ont été traitées par FASTQC pour l'évaluation de la qualité et alignées sur le génome humain à l'aide de Bowtie2 (V2.2.5) [27].

L'algorithme edgeR a été exécuté pour identifier les gènes exprimés de manière différentielle entre les cellules exprimant KLF5K369Q et KLF5K369R et le traitement et le contrôle NTZ dans les cellules exprimant KLF5K369Q, avec un |fold change| ≥ 1,5 et un taux de fausse découverte < 0,05. Nos données de séquençage ont été déposées dans la base de données Gene Expression Omnibus avec le numéro d'accession GSE216126.

Pour les gènes dont l'expression a été modulée spécifiquement par KLF5K369Q et cette modulation a été atténuée par NTZ, l'analyse de survie de Kaplan-Meier a été réalisée pour évaluer si les changements d'expression d'un gène dans le cancer de la prostate humain sont liés à la survie du patient. Nous avons analysé les données de la Stand Up To Cancer/Prostate Cancer Foundation (SU2C/PCF) East Coast Dream Team (ECDT) (https://www.cbioportal.org/) à l'aide du package Survival R. Les patients ont été répartis en deux groupes en fonction du niveau d'expression médian d'un gène dans chaque ensemble de données. Le test du log-rank a été utilisé pour calculer les valeurs de p. Des rapports de risque univariés ont également été calculés.

Les gènes significativement associés à la survie ont été comparés pour les niveaux d'expression parmi les tissus prostatiques normaux, les cancers de la prostate et les métastases osseuses à l'aide de l'ensemble de données SU2C/PCF [28] et de l'ensemble de données GSE21034 [29]. Le test de somme des rangs de Wilcoxon a été utilisé pour déterminer les valeurs p pour les comparaisons entre deux groupes, tandis que le test de Kruskal-Wallis a été utilisé pour les comparaisons multigroupes. Des tests statistiques bilatéraux ont été effectués et une valeur p < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative. Toutes les analyses ont été exécutées en R4.1.3 (https://www.R-project.org/).

L'ARN total a été extrait des cellules à l'aide du kit d'extraction d'ARN total Eastep Super (Cat #: LS1040, Promega, Shanghai, Chine) et quantifié à l'aide du NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific, Madison, USA). L'ADNc simple brin a été synthétisé à partir de 1 μg d'ARN total à l'aide du kit HiScript III All-in-one RT SuperMix (Cat #: R333-01, Vazyme, Nanjing, Chine). Pour la qRT-PCR, la matrice d'ADNc a été mélangée avec le réactif SYBR Green dans de l'eau sans enzyme, et le système tactile Qtower3 (Analytik Jena, Jena, Allemagne) a été utilisé pour la PCR avec le programme suivant : dénaturation initiale à 95 °C pour 5 min, 40 cycles de 95°C pendant 30 s, 60°C pendant 30 s et 72°C pendant 30 s, et une fusion finale pendant 15 s. GAPDH a été utilisé comme contrôle interne. Les séquences d'amorce étaient les suivantes : 5′-CTTGAGCGAGTCCAAAGACTG-3′ (MYBL2 avant), 5′-AGTTGGTCAGAAGACTTCCCT-3′ (MYBL2 inverse), 5′-CAGCATTTCATCGAGGTAGAGAC-3′ (TIMM8A avant), 5′-AGCCCGACTGTCCAACTTTG-3′ ( TIMM8A inverse), 5′-TGAAGGTGACAGAGCCTCTGGAT-3′ (E-cadhérine vers l'avant), 5′-TGGGTGAATTCGGGCTTGTT-3′ (E-cadhérine inverse), 5′-TGAAGGTGACAGAGCCTCTGGAT-3′ (Vimentine vers l'avant), 5′-CTTGTAGGAGTTGTCGGTTGTTAAG-3 ′ (Vimentine inverse), 5′-GACAATGCCCCTCAAGTGTT-3′ (N-cadhérine vers l'avant), 5′-CCATTAAGCCGAGTGATGGT-3′ (N-cadhérine inverse), 5′-CTTCCAGCAGCCCTACGAC-3′ (Escargot vers l'avant), 5′-CGGTGGGGTTGAGGATCT -3′ (Escargot inverse), 5′-TGTTTCAAGATCTGCGGC-3′ (Slug vers l'avant), 5′-TGCAGTCAGGGCAAGAAAAA-3′ (Slug vers l'arrière), 5′-CCATAAAGGGCAACCAAGAG-3′ (Fibronectine vers l'avant), 5′-ACCTCGGTGTTTGTAAGGTGG-3 ′ (fibronectine inverse), 5′-TGCAGTCAGGGCAAGAAAAA-3′ (Slug inverse), 5′-TGTACCGCTATGGTTACACTCG -3′ (MMP9 avant), 5′-GGCAGGGACGTTGCTTCT-3′ (MMP9 inverse), 5′-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3′ ( GAPDH vers l'avant) et 5′-GTTGCTTAGCCAAATTCGTTGT-3′ (GAPDH vers l'arrière).

Les cellules dans des plaques à 6 puits ont été lavées avec du PBS froid et collectées dans un tampon de lyse contenant des inhibiteurs de phosphatase et de protéase (Cat #: P1045, Beyotime) pour extraire les protéines. Après centrifugation pendant 10 min à 4°C dans une centrifugeuse réfrigérée, le surnageant a été recueilli et mélangé avec le tampon de chargement 4×, bouilli dans un bain de chaleur métallique à 100°C pendant 10 min, puis soumis à 10% SDS-PAGE . Les protéines ont été transférées sur une membrane de PVDF activé (taille des pores de 0,45 μm, Cat # : IPVH00010, Millipore, Carrigtwohill, Irlande). La membrane a été bloquée avec du lait écrémé à 5 % pendant 40 min à température ambiante, incubée avec un anticorps primaire à 4 °C pendant une nuit, lavée avec du PBS 3 fois (10 min chacune) et incubée avec un anticorps secondaire conjugué à la HRP contre l'IgG de lapin. (1:5000, Cat #:7074S, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) pendant 1 h à température ambiante. Les signaux ont été visualisés à l'aide du réactif de substrat ECL (Cat #: K-12043-D20, Advansta, Californie, États-Unis) dans un analyseur de chimiluminescence automatique (ChampChemi 610 plus, Pékin, Chine). L'anticorps GAPDH a été acheté auprès de Cell Signaling Technology (1:2000, Cat #: 5174S), l'anticorps KLF5 provenait de Proteintech (1:1000, Cat #: 21017-1-AP, Chicago, USA), l'anticorps MYBL2 provenait de Abcam (1:2000, Cat # : ab76009, Cambridge, MA, USA) et l'anticorps MMP9 provenait d'Abcam (1:2000, Cat # : ab 76003).

Les petits ARN interférents (siARN) pour KLF5 et le contrôle négatif ont été synthétisés par Ribobio (Guangzhou, Chine) et utilisés pour transfecter des cellules à 50 nM à l'aide du réactif Lipofectamine RNAiMax (Cat # : 13778150, Invitrogen) conformément aux instructions du fabricant. Après 48 h, les cellules ont été collectées pour des analyses, y compris le test d'efficacité de knockdown par western blot. La séquence du siARN de KLF5 était 5′-AAGCUCACCUGAGGACUCA-3′ [30].

Le test ChIP a été effectué à l'aide du kit SimpleChIP Enzymatic Chromatin IP (Cat #: 9003s, Cell Signaling Technology) conformément aux instructions du fabricant. En bref, les cellules ont été traitées avec du formaldéhyde à 1 % pendant 10 min pour la réticulation, trempées avec de la glycine pendant 5 min à température ambiante, collectées et digérées avec de la nucléase micrococcique pendant 20 min à 37 °C. Après avoir arrêté la réaction en ajoutant de l'EDTA, l'ADN a été fragmenté par sonication et les extraits ont été incubés avec l'anticorps KLF5 (Cat # : 21017-1-AP, Proteintech) ou IgG (Cat # : 2729P, Cell Signaling Technology). Les fragments d'ADN élués ont été détectés par PCR régulière et PCR quantitative en temps réel à l'aide des amorces suivantes : 5′-CCTTCCTCGGTCTTCGCTAT-3′ (MYBL2 #1 vers l'avant), 5′-GCACTTTTCTATCTCCCGCCA-3′ (MYBL2#1 vers l'arrière), 5′- CCTGGAGATACTGGTGTGCAT-3′ (MYBL2 #2 vers l'avant) et 5′-GGCCAAAAGAAACGGCCTCT-3′ (MYBL2 #2 vers l'arrière).

KLF5 de type sauvage et les mutants KLF5K369Q et KLF5K369R ont été clonés dans le vecteur d'expression pET15b (Cat #: ZK146, Zoman Biotechnology, Pékin, Chine), dans lequel une étiquette histidine a été ajoutée à l'extrémité N de la protéine KLF5 lors de l'expression. Les plasmides ont été exprimés dans la souche BL21 DE3 d'E. coli (Cat # : EC1003, Weidi Biotechnology, Shanghai, Chine). Les bactéries ont été collectées par centrifugation, soniquées dans de l'imidazole 10 mM dans du PBS (10 mM, pH 7, 4) et incubées avec la résine His60 Ni Superflow (Cat #: L00666, GenScript, Nanjing, Chine). Les complexes de résine His-KLF5 ont été lavés et élués avec de l'imidazole 300 mM dans du PBS (10 mM, pH 7,4). La protéine KLF5 a été purifiée davantage par filtration sur gel sur une colonne Superdex 200 Augmentation 10/300 (Cat # : 10243519, GE, MA, USA) en utilisant un PBS (10 mM, pH 7,4) pour une utilisation dans des tests de liaison.

La protéine KLF5 de type sauvage ou mutante à 1 μM dans 2 ml de PBS a été mesurée pour le spectre de fluorescence à l'aide d'un spectromètre de fluorescence (HORIBA, Kyoto, Japon), et les spectres de fluorescence ont été obtenus pour des longueurs d'onde de 300 à 500 nm. NTZ avec différentes plages de concentration et différents incréments ont été utilisés dans l'analyse, y compris 0,1 à 1 μM avec un incrément de 0,1 μM, 1 à 5 μM avec un incrément de 0,5 μM, 5 à 10 μM avec un incrément de 1 μM et 10 –30 μM avec un incrément de 5 μM. L'incubation avec NTZ a duré 5 s à température ambiante. Les données ont été traitées et ajustées pour obtenir les affinités de liaison à l'aide du logiciel Origin (OriginLab, Northampton, MA, USA), et les valeurs de Kd ont été déterminées par les réponses à une longueur d'onde de 290 nm.

La protéine KLF5 purifiée ou son mutant à 0,5 mg/mL dans 0,5 mL a été incubée avec de la résine His60 Ni Superflow pendant 30 min à température ambiante. Après deux lavages, les complexes protéines-billes ont été dilués à 1 ml dans du PBS. La résine His60 Ni Superflow sans protéine a été utilisée comme témoin négatif (c'est-à-dire à blanc). Dix microlitres de NTZ 1 mM ont été ajoutés aux complexes protéines-billes et incubés pendant 1 h à température ambiante. Les réactions ont été lavées avec du PBS puis incubées avec de l'acétonitrile pour dénaturer la protéine et libérer la NTZ capturée. La NTZ dans le surnageant a ensuite été détectée par analyse HPLC à l'aide de l'instrument Agilent 1260 Infinity II (Californie, États-Unis) et de la colonne C18 (25 cm × 4,6 mm, 5 μm) avec un débit de 0,5 mL/min pendant 20 min à la longueur d'onde de 298 nm.

La protéine KLF5 de type sauvage ou mutante dans 2 ml de PBS à 0, 01 mg / ml a été analysée à l'aide d'un spectropolarimètre CD (Chirascan, Applied Photophysics, Surrey, Royaume-Uni) à 200–260 nm. Les spectres ont été enregistrés dans une cuvette de 1 cm de longueur de trajet. Une moyenne de trois balayages répétés ont été effectués sur chaque spectre. La NTZ a été ajoutée à la solution de protéines à une concentration finale de 1 μM et incubée pendant 2 h à 4 ° C avant la détection de CD.

Les données quantitatives ont été présentées sous forme de moyennes ± SD, et toutes les expériences ont été répétées au moins trois. Le test t de Student ou l'ANOVA unidirectionnelle a été utilisé pour l'analyse statistique. Toutes les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du logiciel GraphPad Prism 6 [31]. Une valeur p < 0,05 était considérée comme statistiquement significative.

Nous avons confirmé que, parmi les lignées cellulaires de cancer de la prostate couramment utilisées (LNCaP, C4-2B, PC-3 et DU 145), les cellules PC-3 exprimaient le niveau le plus élevé de KLF5 (fichier supplémentaire 1 : Fig. S1a). Nous avons donc choisi les lignées cellulaires KLF5-null PC-3 précédemment établies exprimant le KLF5 de type sauvage, le mutant Ac-KLF5-imitant KLF5K369Q et le mutant KLF5K369R déficient en acétylation [23] pour le criblage de médicaments et la modélisation des métastases. Les niveaux d'expression de KLF5 dans ces lignées cellulaires sont illustrés à la Fig. S1b. Nous avons également validé que les cellules exprimant KLF5K369Q étaient plus migratrices (fichier supplémentaire 1 : Fig. S1c, S1d) et invasives dans le test transwell (fichier supplémentaire 1 : Fig. S1e, S1f) que les cellules exprimant KLF5 et KLF5K369R. Comme prévu, les cellules exprimant KLF5K369Q exprimaient également des niveaux plus élevés de marqueurs mésenchymateux, notamment la vimentine, la N-cadhérine, l'escargot, la limace et la fibronectine (fichier supplémentaire 1 : Fig. S1g, S1h).

Le test d'invasion de sphéroïdes 3D a été utilisé pour tester des médicaments approuvés par la FDA en 1987 pour leur capacité à inhiber l'invasion cellulaire (Fig. 1a). À 10 μM, 87 des 1987 médicaments ont inhibé l'invasion cellulaire d'au moins 50 %, dont 9 agents de chimiothérapie, 32 médicaments anticancéreux ciblés et 46 médicaments non oncologiques (Fig. 1b, c ; Fichier supplémentaire 2 : Tableau S1).

Pour les 87 médicaments, nous avons répété le dépistage d'invasion en utilisant une série de concentrations pour chaque médicament, y compris 0, 0,001, 0,01, 0,1, 1 et 10 μM. Les effets de ces médicaments sur l'invasion cellulaire sont répertoriés dans le tableau S1. Le test d'invasion avec plusieurs concentrations de médicaments a été répété pour les 25 premiers des 87 médicaments qui ont montré une inhibition de l'invasion dose-dépendante, et leurs capacités d'inhibition de l'invasion ont été à nouveau confirmées (fichier supplémentaire 2 : tableau S2). Ces 25 médicaments sont répertoriés dans le tableau 1 dans l'ordre de leurs capacités d'inhibition de l'invasion.

Pour ces 25 médicaments, nous avons recherché dans la base de données PubMed des publications contenant le nom d'un médicament et « cancer », « métastase » ou « métastase osseuse » pour évaluer si ces médicaments ont été impliqués dans le cancer et les métastases. Sur les 25 médicaments, 11 avaient été bien impliqués dans le cancer ou les métastases dans la littérature, tandis que 14 avaient peu ou pas de publications liées au cancer (tableau 1).

Sur les 25 médicaments, 6 ont inhibé l'invasion cellulaire de plus de 50 % à 0,1 μM, notamment le nifuratel, la mitomycine C, le nitazoxanide, le ronidazole, la rétapamuline et la furagin (Fig. 1d, Tableau 1). Parmi les 6 médicaments, la mitomycine C et le ronidazole ont été exclus pour une étude plus approfondie, car le premier a été largement utilisé pour traiter le cancer et les métastases cancéreuses, tandis que le second est un agent antiprotozoaire utilisé en médecine vétérinaire mais non approuvé pour un usage humain. Pour les 4 médicaments restants, nous avons déterminé la spécificité de destruction et les valeurs IC50 dans les cellules cancéreuses de la prostate PC-3 et DU 145 exprimant KLF5, KLF5K369Q et KLF5K369Q à l'aide du test CCK-8. Seul le nitazoxanide (NTZ) des 4 médicaments a montré une IC50 relativement plus petite sur les cellules exprimant KLF5K369Q que sur les cellules exprimant KLF5 et KLF5K369R (tableau 2). La NTZ était également plus puissante dans l'inhibition de l'invasion en exprimant KLF5K369Q que les cellules exprimant KLF5 (fichier supplémentaire 1 : Fig. S2a, S2b). NTZ a donc été sélectionné pour des analyses supplémentaires.

Une gamme plus large de concentrations de NTZ a été testée pour leur effet sur les cellules PC-3-KQ et DU 145-KQ en utilisant le test CCK-8. Comme le montrent les Fig. S3a et S3b, NTZ n'a pas affecté le nombre de cellules à des concentrations plus faibles (0 à 0, 1 μM), mais a diminué le nombre de cellules à des concentrations plus élevées. Dans le test de formation de colonies, NTZ a réduit le nombre de colonies avec des concentrations plus élevées (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S3c-S3f).

Les modes de prévention et de thérapie ont été utilisés pour déterminer si NTZ inhibe les métastases osseuses induites par Ac-KLF5. En mode prévention (Fig. 2a), des cellules cancéreuses de la prostate exprimant le mutant KLF5K369Q imitant Ac-KLF5 (c.-à-d. PC-3-KQ-Luc) ont été injectées à des souris via l'artère caudale de la queue en suivant une procédure récemment décrite [26 ]. Cinq semaines après l'injection de cellules, des métastases osseuses étaient évidentes pour les cellules PC-3-KQ-Luc, car l'intensité de la bioluminescence était assez forte, selon une expérience pilote (données non présentées).

Le nitazoxanide exerce un effet préventif sur les métastases osseuses induites par Ac-KLF5 dans les cellules cancéreuses de la prostate. un schéma de la chronologie expérimentale. Au jour 0, des cellules cancéreuses (PC-3-KQ-Luc ou PC-3-KR-Luc) ont été injectées à des souris via l'artère caudale de la queue, tandis que le nitazoxanide a été administré par voie intragastrique. Les intensités de bioluminescence ont été mesurées au jour 35. b, c Images de bioluminescence (à gauche) de souris portant des cellules PC-3-KQ (b) ou des cellules PC-3-KR (c) et recevant du nitazoxanide (NTZ) ou le solvant témoin (véhicule ). Les intensités de bioluminescence sont indiquées par le flux de photons de la région d'intérêt (ROI) (panneau de droite, chaque point représente une patte de souris). n = 12 pattes/groupe. d Le traitement au nitazoxanide a significativement réduit les zones tumorales osseuses formées par les cellules PC-3-KQ sans affecter celles des cellules PC-3-KR. Des sections de fémur ont été colorées avec H&E, et des zones de cellules tumorales et des sections osseuses entières ont été mesurées et comparées entre le traitement NTZ et le groupe témoin. Les images représentatives sont affichées à gauche et les résultats statistiques sont affichés à droite. n = 6 tumeurs pour chaque groupe. B, régions osseuses trabéculaires ; BM, régions de la moelle osseuse ; T, régions tumorales. Barre d'échelle, 100 μm. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD. **p < 0,01 ; ***, p < 0,001 ; ns, pas significativement différent ; tel qu'estimé par le test t de Student

Dans ce modèle, l'administration de NTZ en même temps que l'injection de cellules tumorales a considérablement réduit les métastases osseuses, comme l'indiquent les signaux de bioluminescence (Fig. 2b). Pendant ce temps, les cellules PC-3-KR-Luc ont généré des signaux de bioluminescence beaucoup plus faibles (Fig. 2c). La NTZ n'a pas eu d'effet significatif sur l'intensité de la bioluminescence des cellules PC-3-KR-Luc (Fig. 2c). L'histomorphométrie osseuse des coupes de tissu osseux a révélé que la NTZ diminuait de manière significative la surface des cellules tumorales chez les souris avec des cellules PC-3-KQ-Luc (Fig. 2d). En revanche, les souris avec des cellules PC-3-KR-Luc avaient des zones tumorales beaucoup plus petites, qui n'étaient pas significativement affectées par la NTZ (Fig. 2d).

Le poids corporel des souris traitées au NTZ n'a montré de changement notable après 5 semaines dans aucun des groupes (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S4a, S4b). De plus, aucune souris dans aucun groupe traité au NTZ n'a présenté d'effets indésirables graves, de mortalité ou de changements histopathologiques notables dans le cœur, les poumons, le foie, la rate et les reins (fichier supplémentaire 1 : Fig. S4c).

En mode thérapeutique, les cellules PC-3-KQ-Luc injectées à des souris ont pu développer des métastases osseuses pendant 7 jours avant l'administration de NTZ. 7 jours après l'injection de cellules, des signaux de bioluminescence étaient évidents chez la plupart des souris (fichier supplémentaire 1 : Fig. S5). Les souris ont été divisées en deux groupes en fonction des intensités du signal de bioluminescence des souris (Fig. 3a et fichier supplémentaire 1 : Fig. S5). Les souris ont été sacrifiées pour analyse après 4 semaines de traitement NTZ. Semblable à la découverte du mode préventif, le traitement NTZ a fortement diminué les intensités de bioluminescence (Fig. 3b). L'analyse micro-CT a démontré que, alors que les lésions osseuses étaient évidentes dans le groupe témoin, le traitement NTZ réduisait significativement ces lésions (Fig. 3c). L'analyse quantitative des paramètres osseux a révélé que la NTZ augmentait significativement BV/TV, Tb. N et Tb. Th tout en diminuant puissamment Tb. Sp (fig. 3d). La quantification des coupes H&E de tissus osseux a confirmé que la NTZ réduisait significativement la zone tumorale dans l'os (Fig. 3e). Le poids corporel des souris n'a pas été affecté par la NTZ (Fig. 3f).

Le traitement au nitazoxanide inhibe les métastases osseuses ostéolytiques du cancer de la prostate dans un modèle murin. un schéma de la chronologie de l'expérience. Les cellules tumorales ont été autorisées à coloniser et à se développer pendant 7 jours après l'injection via l'artère caudale et avant l'administration de NTZ par injection intragastrique (six souris par groupe). b Images de bioluminescence (à gauche) et intensités (à droite) de souris après traitements avec NTZ ou véhicule pendant 28 jours. n = 12 pattes/groupe. c Images micro-CT représentatives des fémurs et des tibias (à gauche) et photomicrographies micro-CT des fémurs (XZ à droite). La flèche blanche indique l'ostéolyse formée dans la métaphyse du fémur, qui a disparu après le traitement NTZ. d Quantifications de plusieurs paramètres de la microstructure osseuse, dont le volume osseux par volume tissulaire (BV/TV, n = 6 fémurs pour chaque groupe), le nombre trabéculaire (Tb.N, n = 6 fémurs pour chaque groupe), la séparation trabéculaire (Tb. Sp, n = 6 fémurs dans le groupe témoin, n = 5 fémurs dans le groupe NTZ) et l'épaisseur trabéculaire (Tb.Th, n = 4 fémurs dans le groupe témoin, n = 5 fémurs dans le groupe NTZ). e Coloration H&E de sections osseuses montrant des zones de cellules tumorales (T), d'os (B) et de moelle osseuse (BM) (à gauche). Le rapport entre la surface tumorale et la surface osseuse a été calculé pour chaque souris et présenté dans le graphique de droite. Barre d'échelle dans les images H&E, 100 μm. n = 4 fémurs dans le groupe témoin, n = 5 fémurs dans le groupe NTZ. f Poids corporels des souris à différents moments après traitement avec NTZ ou véhicule. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD. **, p < 0,01 ; ***, p < 0,001 ; tel qu'estimé par le test t de Student. NTZ, nitazoxanide

La différenciation des ostéoclastes est un mécanisme essentiel permettant à Ac-KLF5 d'induire des métastases osseuses dans le cancer de la prostate [23]. Pour déterminer si NTZ atténue la différenciation des ostéoclastes induite par Ac-KLF5, nous avons d'abord testé la cytotoxicité de NTZ dans des cellules RAW264.7, un modèle de lignée cellulaire de différenciation des ostéoclastes. Dans le test de viabilité cellulaire CCK-8, NTZ n'a pas présenté de cytotoxicité détectable dans les cellules RAW264.7 à des concentrations inférieures à 25 μM après 48 h de traitement (Fig. 4a). Au cours de la différenciation des ostéoclastes induite par RANKL dans les cellules RAW264.7, qui a duré 7 jours, le traitement par NTZ a diminué le nombre de cellules multinucléées TRAP + de manière dose-dépendante (Fig. 4b, c). Même 6, 25 et 12, 5 μM de NTZ, qui ne provoquaient pas de cytotoxicité dans les cellules RAW264.7 (Fig. 4a), réduisaient encore de manière significative le nombre de cellules multinucléées TRAP + (Fig. 4c). Par conséquent, la NTZ atténue probablement la différenciation des ostéoclastes.

Le nitazoxanide atténue la différenciation des ostéoclastes induite par Ac-KLF5. a Effets de NTZ à différentes concentrations sur la viabilité des cellules RAW264.7 après 48 h de traitement, tel que déterminé par le test CCK8. b, c NTZ inhibe la différenciation des ostéoclastes de manière dose-dépendante, comme déterminé par la coloration TRAP des cellules RAW264.7 traitées avec RANKL (50 ng/mL) et diverses concentrations de NTZ pendant 5 jours. Sont présentées des images représentatives de TRAP + et de cellules multinucléées (noyaux> 3) (b) et leur nombre par puits (c). Une analyse ANOVA unidirectionnelle a été effectuée sur les données. d NTZ a inhibé la différenciation des ostéoclastes des cellules RAW264.7 causée par le milieu conditionné (CM) des cellules PC-3-KQ, comme indiqué par des images représentatives de cellules colorées TRAP (à gauche) et le nombre de cellules TRAP + par puits (à droite) après Traitements NTZ. Une analyse ANOVA unidirectionnelle a été effectuée sur les données. e NTZ a inhibé la différenciation des ostéoclastes des cellules RAW264.7 co-cultivées avec des cellules PC-3-KQ, comme indiqué par des images représentatives de cellules colorées TRAP (à gauche) et le nombre de cellules TRAP + par puits (à droite) après les traitements NTZ. Une analyse ANOVA unidirectionnelle a été effectuée sur les données. f NTZ a diminué le nombre d'ostéoclastes induits par Ac-KLF5 dans les os de souris, comme l'indiquent les images de coupes osseuses avec des cellules TRAP + (à gauche) et le nombre d'ostéoclastes (N.Oc) par mm de surface osseuse (BS). Barre d'échelle, 200 μm. Le test t de Student a été réalisé. n = 5 fémurs dans le groupe véhicule, n = 5 fémurs dans le groupe NTZ. Pour tous les graphiques à barres, les données sont affichées sous forme de moyenne ± SD. **, p < 0,01 ; ***, p < 0,001. T, cellules tumorales ; B, os ; BM, moelle osseuse ; NTZ, nitazoxanide; RANKL, activateur du récepteur du ligand du facteur nucléaire-κB ; TRAP, phosphatase acide tartrate-résistante

Nous avons également collecté des milieux conditionnés (CM) à partir de cellules PC-3-KQ traitées avec NTZ à différentes concentrations (0, 1,25, 2,5 et 5 μM) pendant 36 h et utilisé le CM pour traiter les cellules RAW264.7 en présence d'un RANKL plus dilué (10 ng/mL) pendant 7 jours. Le nombre de cellules multinucléées TRAP + a été significativement réduit par CM à partir de cellules traitées avec NTZ à 2, 5 ou 5 μM (Fig. 4d).

Le troisième modèle pour les ostéoclastes induits par Ac-KLF5 était la co-culture de cellules RAW264.7 avec des cellules PC-3-KQ en présence de NTZ (0, 1,25, 2,5 et 5 μM) pendant 7 jours et le TRAP subséquent coloration. La co-culture a considérablement augmenté, tandis que le traitement au NTZ aux 3 concentrations a considérablement réduit le nombre de cellules multinucléées TRAP + (Fig. 4e). Dans les fémurs de souris, la coloration TRAP a révélé que le traitement NTZ réduisait de manière significative le nombre de cellules TRAP + par rapport au groupe véhicule (Fig. 4f).

MMP9 est critique dans les métastases du PCa [32], y compris la résorption osseuse lors des métastases osseuses [33]. Nous avons constaté que le KLF5K369Q imitant l'Ac-KLF55 induisait de manière significative l'expression de MMP9 aux niveaux des protéines et de l'ARNm par rapport au KLF5K369R déficient en acétylation (fichier supplémentaire 1 : Fig. S6a, S6b) et que la NTZ diminuait l'expression de MMP9 de manière dose-dépendante dans Cellules exprimant KLF5K369Q (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S6a, S6b). La diminution de l'expression de la protéine MMP9 par NTZ a été confirmée dans les métastases osseuses induites par KLF5k369Q par coloration immunohistochimique (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S6c). Par conséquent, l'inhibition des métastases osseuses médiée par NTZ peut également impliquer la régulation à la baisse de MMP9 par NTZ.

Pour comprendre comment NTZ supprime les métastases osseuses induites par KLF5K369Q, le séquençage de l'ARN a été réalisé à l'aide de cellules PC-3-KQ et PC-3-KR en présence ou en l'absence de NTZ (5 μM). Nous nous sommes concentrés sur les gènes dont les profils d'expression étaient modulés par KLF5K369Q, mais la modulation de KLF5K369Q était inversée par le traitement NTZ. Au total, il y avait 2836 gènes exprimés de manière différentielle entre KLF5K369Q et KLF5K369R, avec 1779 régulés positivement et 1057 régulés négativement par KLF5K369Q (Fig. 5a). Les modèles d'expression modulés par KLF5K369Q ont été inversés par le traitement NTZ pour 241 des 2836 gènes exprimés de manière différentielle. Les 241 gènes comprenaient 127 régulés positivement et 114 régulés négativement par KLF5K369Q (Fig. 5b, c; Fichier supplémentaire 2 : Tableau S3, Tableau S4).

Le nitazoxanide inverse les effets de l'Ac-KLF5 sur l'expression de nombreux gènes dans les cellules PC-3. a Parcelles Volcano de tous les gènes quantifiés à partir des profils d'expression génique entre le KLF5K369Q et le KLF5K369R dans les cellules PC-3. b Nuage de points des gènes différentiellement exprimés (DEG) entre les cellules PC-3-KQ avec et sans traitement NTZ et les DEG entre les cellules PC-3-KQ et PC-3-KR. Les points dans le quadrant supérieur gauche représentent les gènes qui ont été régulés négativement par KLF5K369Q mais régulés positivement par NTZ, tandis que les points dans le quadrant inférieur droit indiquent les gènes qui ont été régulés positivement par KLF5K369Q mais régulés négativement par NTZ dans les cellules PC-3. Une valeur p ajustée <0,05 a été utilisée pour définir tous les gènes altérés. c Carte thermique montrant les DEG dans les quadrants supérieur gauche et inférieur droit du panneau A. La barre de couleur à droite indique les changements de pli log2 (Log2FC)

Nous avons évalué les 241 gènes modulés par KLF5K369Q et sensibles à la NTZ pour l'association de leurs niveaux d'expression avec la survie des patients atteints de cancer de la prostate à l'aide de la base de données SU2C. Des données de survie étaient disponibles pour 119 des 127 gènes régulés positivement par KLF5K369Q et régulés négativement par NTZ et 111 des 114 gènes régulés négativement par KLF5K369Q et régulés positivement par NTZ (fichier supplémentaire 2 : tableau S5). Sur les 119 gènes régulés positivement par KLF5K369Q et régulés négativement par NTZ, seule la régulation positive de MYBL2 et TIMM8A était associée de manière significative à une SG plus faible du patient (Fig. 6a), un schéma cohérent avec la fonction de suppression des métastases de NTZ. La régulation à la hausse de 5 gènes, dont INHBB, COL4A6, CACNG8, PIANP et C2orf78, était significativement associée à un meilleur système d'exploitation au lieu d'un pire système d'exploitation (fichier supplémentaire 1 : Fig. S7a). La régulation à la hausse des 112 gènes restants n'a pas affecté de manière significative la survie des patients (fichier supplémentaire 2 : tableau S5). Par conséquent, MYBL2 et TIMM8A sont plus susceptibles de médier l'induction de métastases osseuses par Ac-KLF5.

Association des gènes réactifs à Ac-KLF5 et NTZ avec la survie des patients. a Des niveaux d'expression plus élevés de 7 gènes sont en corrélation avec la survie globale (SG) chez les patients atteints d'un cancer de la prostate, comme déterminé par l'analyse de Kaplan-Meier à l'aide de l'ensemble de données SU2C. b Les niveaux d'expression de 7 gènes réactifs à Ac-KLF5 et NTZ ont été analysés à l'aide de l'ensemble de données GSE21034 [29].

Dans l'ensemble de données GSE21034, les niveaux d'expression de MYBL2 et de TIMM8A étaient disponibles dans les tumeurs primaires, les métastases viscérales et les métastases osseuses du cancer de la prostate [29]. Alors que MYBL2 et TIMM8A étaient exprimés à des niveaux plus élevés dans les métastases que les tumeurs primaires lorsque les métastases viscérales et osseuses étaient combinées (Fig. 6b), seul MYBL2 présentait un niveau d'expression significativement plus élevé dans les métastases osseuses que les tumeurs primaires lorsque les métastases osseuses étaient analysées séparément (Additional fichier 1 : Fig. S7b).

Sur les 111 gènes régulés négativement par KLF5K369Q et régulés positivement par NTZ dans l'ensemble de données SU2C, des niveaux plus élevés de TMPRSS2, CALB1, SPOCK2, COL4A4 et COL4A3 étaient significativement associés à un meilleur système d'exploitation (fichier supplémentaire 1 : Fig. 6a). Cependant, des niveaux plus élevés de 2 gènes (FTH1 et BDH1) étaient associés à une SG du patient plus mauvaise (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S7a).

Nous avons en outre testé si Ac-KLF5 régule transcriptionnellement MYBL2 et TIMM8A. Dans les cellules PC-3 et DU 145 exprimant différentes formes de KLF5, la RT-PCR quantitative a révélé que MYBL2 était significativement induite par KLF5K369Q dans les cellules PC-3 et DU 145, alors que l'induction de TIMM8A n'était pas significative (Fig. 7a ; fichier 1 : Fig. S8a). Lorsque KLF5 a été renversé par les siARN dans les cellules PC-3-KQ, l'expression de MYBL2 a été considérablement réduite aux niveaux de l'ARNm et des protéines (Fig. 7b; Fichier supplémentaire 1: Fig. S8b, S8c). Il a récemment été démontré que MYBL2 favorise la métastase et la résistance à la castration du cancer de la prostate [34]. Par conséquent, nous nous sommes concentrés sur la régulation transactivationnelle de MYBL2 par KLF5K369Q.

Le nitazoxanide atténue la régulation à la hausse de l'expression de MYBL2 par Ac-KLF5 dans les cellules cancéreuses de la prostate. a Expression de MYBL2 et TIMM8A dans des cellules PC-3 et DU 145 exprimant différentes formes de KLF5, déterminée par qPCR. Les lignées cellulaires C4-2B et PC-3 parentales ont été utilisées comme témoins et GAPDH a été utilisée comme témoin de charge. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle avec comparaisons multiples. b Les cellules ont été transfectées avec 50 nM de siKLF5 simultanément avec ou sans traitement NTZ (5 μM) pendant 24 h, puis traitées par qPCR en temps réel. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle avec comparaisons multiples. c NTZ a régulé négativement l'expression de MYBL2 dans les cellules PC-3-KQ et les cellules DU 145-KQ au niveau de l'ARNm, tel que détecté par qPCR. Les traitements au NTZ étaient aux concentrations indiquées pendant 48 h. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle avec comparaisons multiples. d Le traitement par NTZ chez la souris a réduit l'expression de MYBL2 dans les métastases osseuses PC-3-KQ, comme détecté par la coloration IHC et indiqué par les images IHC et les intensités des signaux de coloration. n = 5 tumeurs pour chaque groupe. Le test t de Student a été réalisé. Barre d'échelle, 200 μm. e Le promoteur du gène MYBL2 contenait plusieurs sites de liaison potentiels à KLF5, comme prédit par le programme JASPAR. f, g NTZ a eu des effets différents sur la liaison de Ac-KLF5 à différents sites de liaison Ac-KLF5 du promoteur du gène MYBL2, tel que déterminé par puce et RT-PCR régulière (f) ou qPCR en temps réel (g) en utilisant PC -Cellules 3-KQ traitées avec NTZ pendant 48 h et cellules PC-3-KR. Tous les graphiques à barres sont présentés sous forme de moyenne ± SD de trois expériences indépendantes. *, p < 0,05 ; **, p < 0,01 ; ***, p < 0,001 ; ns, non statistiquement significatif

Dans les cellules PC-3 et DU 145 exprimant KLF5K369Q, le traitement NTZ a réduit l'expression de MYBL2 à la fois au niveau de l'ARNm et de la protéine d'une manière dépendante de la dose ou du temps (Fig. 7c; Fichier supplémentaire 1 : Fig. S8d, Fig. S8e) . Comme l'a révélé la coloration immunohistochimique, le traitement au NTZ chez la souris a également diminué de manière significative l'expression de la protéine MYBL2 dans les tissus osseux (Fig. 7d).

Pour tester davantage l'effet de NTZ sur la transcription induite par Ac-KLF5 de MYBL2, nous avons analysé la séquence promotrice de MYBL2 à l'aide du logiciel Jaspar pour identifier les sites de liaison potentiels de KLF5 (Fig. 7e) et avons effectué une ChIP-PCR à l'aide d'amorces couvrant les 6 potentiels. Sites de liaison KLF5 avec les scores de liaison les plus élevés. Pour les 5 sites de liaison potentiels entre -80 et -130 nucléotides, aucune liaison évidente n'a été détectée en utilisant 2 paires d'amorces (Fig. 7f). Pour le site de liaison possible entre -1242 et -1251 nucléotides, CHIP-PCR a révélé une occupation évidente de KLF5K369Q mais pas de KLF5K369R sur le promoteur MYBL2. Le traitement au NTZ a considérablement réduit l'ADN lié à KLF5K369Q (Fig. 7f et g).

Nous avons testé si NTZ se lie directement à la protéine KLF5 en utilisant différents tests (Fig. 8). Dans le test d'extinction de fluorescence, NTZ a réduit l'intensité de fluorescence de KLF5, KLF5K369Q et KLF5K369R de manière dose-dépendante (Fig. 8a), avec une constante de liaison Kd de 7,2, 5,4 et 7,3 μM, respectivement (Fig. 8b) . Dans la spectroscopie CD, les trois formes de KLF5 présentaient des pics négatifs entre 205 nm et 220 nm, ce qui indique des modifications dans la structure secondaire d'une protéine [35]. Le traitement NTZ a diminué l'intensité de ces pics négatifs sans modifier la forme du spectre (Fig. 8c), suggérant une perte des structures en hélice α. L'analyse HPLC a également confirmé que la NTZ se lie à la protéine KLF5 quel que soit le statut d'acétylation de KLF5 (Fig. 8d).

NTZ se lie à la protéine KLF5 quel que soit son statut d'acétylation. a Les intensités de fluorescence des protéines KLF5, KLF5K369Q et KLF5K369R ont été mesurées après incubation avec différentes concentrations de NTZ. b Calcul des valeurs de Kd pour la constante de dissociation à l'aide du logiciel Origin et en ajustant les données d'extinction de fluorescence. c Spectres de dichroïsme circulaire (CD) de KLF5, KLF5K369Q et KLF5K369R incubés avec NTZ. Les concentrations des protéines et de la NTZ sont de 0,2 μM. d Liaison de NTZ aux différentes formes purifiées de protéines KLF5 par analyse HPLC

Dans ces tests de liaison médicament-protéine, nous avons utilisé le rétinoïde synthétique Am80 comme contrôle négatif, car Am80 se lie à RARα pour favoriser son association avec KLF5 dans la régulation des gènes sans liaison directe à KLF5 [36]. Am80 ne s'est lié à aucune forme de la protéine KLF5 dans le test d'extinction de la fluorescence, car le Kd était supérieur à 30 μM (fichier supplémentaire 1 : Fig. S9a et S9b). Am80 n'a pas non plus modifié la structure secondaire de KLF5, quel que soit le traitement NTZ (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S9c).

Les résultats de cette étude présentent le nitazoxanide (NTZ), un médicament actuellement approuvé pour le traitement des infections parasitaires et virales [37, 38], comme un agent thérapeutique potentiel pour le traitement des métastases osseuses PCa. La preuve directe de cette conclusion est venue des expérimentations animales, où le traitement NTZ a considérablement supprimé la formation de métastases osseuses dans un modèle murin établi, c'est-à-dire de métastases osseuses induites par KLF5K369Q (Figs. 2 et 3). L'inhibition des métastases osseuses était efficace dans les modes préventif et thérapeutique, car des efficacités similaires ont été observées lorsque la NTZ était administrée au même moment de l'inoculation cellulaire (Fig. 2) ou une semaine après (Fig. 3).

Les cancers de la prostate, du sein et du poumon métastasent souvent à l'os [39,40,41]. Alors que les cancers du sein et du poumon subissent principalement des métastases ostéolytiques, le cancer de la prostate provoque à la fois des lésions ostéolytiques et ostéoblastiques [39,40,41]. Divers facteurs affectent l'équilibre entre les activités pro-ostéoclastiques et pro-ostéoblastiques des cellules cancéreuses de la prostate [40, 41]. Par exemple, dans le microenvironnement osseux, les cellules cancéreuses de la prostate sécrètent des facteurs solubles liés à l'os tels que RANKL et M-CSF pour activer les ostéoclastes ; et les ostéoclastes libèrent à leur tour du TGF-β et de l'IGF-1 pour soutenir la croissance des cellules cancéreuses de la prostate [40, 41]. De plus, les ostéoclastes libèrent des facteurs ostéolytiques tels que le peptide lié à l'hormone parathyroïdienne (PTHrP) pour favoriser la différenciation et la survie des ostéoblastes [39, 40]. Par conséquent, la différenciation des ostéoclastes joue un rôle important dans les métastases osseuses du cancer de la prostate, et l'inhibition de la différenciation des ostéoclastes peut atténuer efficacement les métastases osseuses du cancer de la prostate. Notre étude précédente a démontré que la différenciation des ostéoclastes est un mécanisme cellulaire permettant à KLF5K369Q d'induire des métastases osseuses ostéolytiques dans le cancer de la prostate [23]. Même dans les cellules C4-2B, qui favorisent principalement les lésions ostéoblastiques dans l'os [42], l'expression ectopique de KLF5K369Q ou KLF5 provoque toujours des lésions osseuses ostéolytiques [23]. Conformément à son effet thérapeutique sur les métastases osseuses, le traitement NTZ a en effet atténué la différenciation des ostéoclastes induite par KLF5K369Q. Un tel effet inhibiteur a été démontré pour la première fois dans un modèle in vitro de différenciation des ostéoclastes, c'est-à-dire des cellules RAW264.7 traitées avec RANKL ou co-cultivées avec des cellules cancéreuses exprimant KLF5K369Q (Fig. 4b – e). L'effet inhibiteur de NTZ sur les ostéoclastes a également été confirmé dans le modèle murin (Fig. 4f). Il convient de noter que même à des concentrations qui ne présentaient pas de cytotoxicité pour les cellules RAW264.7 (Fig. 4a), la NTZ diminuait toujours les ostéoclastes (Fig. 4b, c). Cependant, étant donné que le cancer de la prostate induit plus souvent des lésions ostéoblastiques, il est pertinent de rechercher si la NTZ inhibe également la différenciation et la fonction des ostéoblastes.

L'inhibition de la différenciation des ostéoclastes induite par KLF5K369Q in vitro et in vivo est cohérente avec une étude récente dans laquelle NTZ réduit la perte osseuse chez des souris ovariectomisées en inhibant l'ostéoclastogenèse induite par RANKL [43].

Au niveau moléculaire, il semble que NTZ module directement la fonction de KLF5K369Q dans la transcription génique en inhibant les métastases osseuses. KLF5 est un facteur de transcription et la métastase osseuse médiée par KLF5K369Q est médiée par une série de gènes régulés transcriptionnellement par KLF5K369Q, notamment CXCR4, IL11 et d'autres [23]. KLF5K369Q a régulé positivement ou négativement 2836 gènes par rapport à KLF5K369R (Fig. 5a). Le traitement NTZ a inversé la régulation à la hausse ou à la baisse de 241 gènes par KLF5K369Q (Fig. 5b, c; Fichier supplémentaire 2: Tableau S3, Tableau S4). Ces résultats indiquent que NTZ modifie la fonction de KLF5K369Q dans la transcription de nombreux gènes.

Plusieurs gènes pourraient médier l'effet de NTZ sur les métastases osseuses médiées par KLF5K369Q. Par exemple, deux gènes Ac-KLF5 régulés positivement et NTZ régulés négativement, MYBL2 et TIMM8A, ont été régulés positivement dans le cancer de la prostate humaine. Leur régulation à la hausse était significativement associée à une moins bonne survie globale chez les patients atteints d'un cancer de la prostate (Fig. 6a). Il y avait également 5 gènes régulés négativement par KLF5K369Q et régulés positivement par NTZ dont les niveaux d'expression inférieurs dans les cancers de la prostate humains étaient également significativement associés à une survie globale plus faible, notamment TMPRSS2, CALB1, SPOCK2, COL4A4 et COL4A3 (Fig. 6a). Ces 7 gènes pourraient plus probablement impacter le rôle promoteur de KLF5K369Q dans les métastases osseuses, en plus de CXCR4 et IL11 décrits dans une précédente étude [23].

Parmi les 7 gènes régulés par KLF5K369Q et répondant à NTZ, la MYBL2 (Myb-related protein B) est particulièrement intéressante, car une étude précédente a démontré que MYBL2 favorise la croissance résistante à la castration et les métastases osseuses du cancer de la prostate [34]. De plus, le ciblage de MYBL2 bloque les métastases osseuses dans les cellules cancéreuses de la prostate, et des niveaux d'expression plus élevés de MYBL2 sont associés à un stade tumoral plus élevé, à un grade tumoral plus élevé, à un risque plus élevé de rechute métastatique et à un pronostic plus sombre chez les patients atteints d'un cancer de la prostate [34]. MYBL2 régule la progression du cycle cellulaire, la survie et la différenciation des cellules cancéreuses [44]. Nous avons découvert que le gène MYBL2 était effectivement activé transcriptionnellement par KLF5K369Q dans les cellules cancéreuses de la prostate. Par exemple, KLF5K369Q a régulé positivement tandis que son silence réduisait l'expression de MYBL2, et KLF5K369Q s'est lié à des séquences spécifiques du promoteur MYBL2 pour activer sa transcription alors que KLF5K369R ne l'a pas fait (Fig. 7 ; Fichier supplémentaire 1 : Fig. S8). De plus, le traitement NTZ a réduit l'expression de MYBL2 dans les cellules cultivées et les tumeurs cultivées chez la souris et a compromis la liaison de KLF5K369Q au promoteur MYBL2 (Fig. 7).

Il convient également de noter que KLF5K369Q a régulé à la hausse l'expression de MMP9 et que la régulation à la hausse a été atténuée par le traitement NTZ (Fichier supplémentaire 2 : Tableau S4 ; Fichier supplémentaire 1 : Fig. S6). Les ostéoclastes activés produisent de l'acide et des protéinases telles que les métalloprotéinases matricielles (MMP) pour dégrader la matrice osseuse, libérant plus de TGF-β et d'autres facteurs de croissance dans l'os. Ces facteurs stimulent à leur tour les métastases osseuses, entraînant ce que l'on appelle un cercle vicieux [45]. L'inhibition de l'expression de MMP9 par NTZ dans les cellules exprimant KLF5K369Q pourrait donc également contribuer à l'inhibition des métastases osseuses par NTZ.

La NTZ semble agir directement sur la protéine KLF5 pour moduler ses fonctions, comme l'ont révélé différents tests de liaison médicament-protéine (Fig. 8). Alors que NTZ se lie à la molécule KLF5, la liaison ne semble pas être spécifique à KLF5K369Q, car KLF5 et KLF5K369R ont également montré des capacités de liaison similaires (Fig. 8). Il reste à déterminer comment NTZ agit sur KLF5 et si un tel acte a un impact direct sur la fonction de KLF5 dans la transcription génique.

L'effet inhibiteur de la NTZ sur les métastases osseuses pourrait s'appliquer à d'autres types de tumeurs malignes où les métastases osseuses se produisent fréquemment, et le TGF-β est un inducteur, y compris les carcinomes du sein, du poumon et de la prostate et le myélome multiple [46, 47]. Nous avons précédemment rapporté que le TGF-β induit l'acétylation de KLF5 dans les cellules épithéliales, et l'acétylation de KLF5 est essentielle pour que le TGF-β régule l'expression des gènes et de multiples processus cellulaires tels que la prolifération cellulaire et l'EMT [17, 18, 20, 23, 48 ]. Le mutant KLF5K369Q imitant Ac-KLF5 maintient l'EMT, favorise l'invasion cellulaire et induit des métastases osseuses dans les cellules cancéreuses de la prostate [23]. Par conséquent, l'effet thérapeutique de la NTZ sur les métastases osseuses induites par le KLF5K369Q établi dans cette étude devrait également s'appliquer aux métastases osseuses induites par le TGF-β dans d'autres types de tumeurs malignes.

D'autres médicaments qui ont également supprimé l'invasion des cellules exprimant KLF5K369Q dans le test d'invasion de sphéroïdes cellulaires pourraient également être capables de supprimer les métastases osseuses. La stratégie de dépistage a été développée par Cribbes et al. précédemment [24]. La découverte de l'activité suppressive de NTZ dans les métastases osseuses valide cette stratégie de criblage avec des cellules exprimant KLF5K369Q (Fig. 1). En plus du NTZ, 5 autres médicaments ont également inhibé l'invasion des sphéroïdes cellulaires de plus de 50 % à 0,1 μM. Ils comprenaient le nifuratel, la mitomycine C, le ronidazole, la rétapamuline et la furagin (Fig. 1d, Tableau 1). Alors que la mitomycine C est largement utilisée dans le traitement des métastases [49, 50] et que le ronidazole agit comme un agent vétérinaire, aucun des 3 médicaments restants n'a été impliqué dans les métastases cancéreuses dans la littérature. Ces 3 médicaments méritent donc d'être testés pour leurs rôles thérapeutiques potentiels dans les métastases osseuses.

NTZ est approuvé pour le traitement de diverses maladies infectieuses, y compris les infections protozoaires, anthelminthiques, virales et bactériennes [51]. Bien que notre étude soit la première à démontrer un effet thérapeutique de la NTZ sur les métastases osseuses du cancer de la prostate, son activité anticancéreuse a été rapportée dans des études récentes dans différents types de cancers impliquant divers mécanismes moléculaires. Par exemple, il a supprimé la croissance tumorale du côlon, probablement en induisant un arrêt du cycle cellulaire et en modifiant l'expression de plusieurs molécules [52, 53] ; il a partiellement supprimé la croissance du cancer de l'ovaire en inhibant l'activité de la protéine disulfure isomérase (PDI) [54] ; il a inhibé la formation de sphères dans les cultures 3D de cellules HCC et CRC impliquant l'inhibition d'OXPHOS [55, 56] ; et il a supprimé la croissance du gliome en provoquant l'arrêt du cycle cellulaire G2 / M, en induisant l'apoptose et en inhibant l'autophagie probablement via l'inhibition de CDK1, la régulation à la hausse de ING1, etc. [57, 58]. La NTZ pourrait également empêcher l'induction de tumeurs mammaires par le MNU chez le rat [59].

Au niveau moléculaire, des études antérieures suggèrent que la NTZ pourrait avoir un impact sur les fonctions de plusieurs molécules et moduler diverses voies de signalisation [51]. Par exemple, la NTZ a été identifiée comme un inhibiteur de MYC dans les cellules cancéreuses du sein à l'aide d'un système de dépistage HTS [60] ; La NTZ pourrait agir comme un inhibiteur modéré de la voie STAT3 [61] ; l'inhibition de l'activité de signalisation Wnt par NTZ pourrait être indépendante de l'APC mais implique le ciblage de PAD2 et l'augmentation subséquente de la désamination et du renouvellement de la β-caténine dans les cellules cancéreuses du côlon [62]. Des analyses bioinformatiques suggèrent que dans les cellules HCC, la NTZ pourrait cibler de nombreuses molécules, processus biologiques et voies de signalisation [63]. L'induction de la mort cellulaire par la NTZ et certains de ses dérivés passe également par le ciblage du protéasome 20S [64].

En résumé, nous avons adopté le test de dépistage d'invasion sphéroïde récemment développé pour identifier les médicaments approuvés par la FDA qui ciblent les métastases osseuses induites par le KLF5 acétylé dans le cancer de la prostate. Six des 1987 médicaments ont inhibé l'invasion des sphéroïdes cellulaires de plus de 50 % à 0,1 μM. Ils comprenaient le nitazoxanide, le nifuratel, la mitomycine C, le ronidazole, la rétapamuline et la furagine. Des expériences fonctionnelles ont révélé que NTZ supprimait les métastases osseuses induites par KLF5K369Q en modes préventif et thérapeutique chez la souris. La NTZ a inhibé l'ostéoclastogenèse, un processus cellulaire responsable des métastases osseuses induites par le KLF5K369Q. Mécaniquement, NTZ s'est lié à la molécule KLF5 et a inversé la fonction de KLF5K369Q dans la transcription de nombreux gènes. Deux gènes KLF5K369Q régulés positivement et NTZ régulés négativement, MYBL2 et TIMM8A, étaient régulés positivement dans le cancer de la prostate humain, et la régulation positive était associée à une pire survie des patients. La régulation à la hausse de MYBL2 par KLF5K369Q impliquait une liaison directe au promoteur et NTZ atténuait la liaison. Ces découvertes présentent la NTZ comme un agent thérapeutique potentiel pour les métastases osseuses induites par Ac-KLF5 dans le cancer de la prostate.

Les données à l'appui de cette étude, y compris les résultats de l'écran de la bibliothèque de composés et les résultats de l'analyse du séquençage de l'ARN, sont incluses dans les fichiers de données supplémentaires. L'ensemble de données analysé au cours de l'étude en cours est disponible via le référentiel NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) avec le numéro d'accession. GSE21034, https://identifiers.org/geo:GSE21034. Les données de séquence brutes de cette étude ont été déposées dans le GEO avec le numéro d'accession GSE216126 et le lien Web pour cette étude est https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/?term=GSE216126.

Facteur de type Krüppel 5

KLF5 acétylé

KLF5 acétylé

KLF5 désacétylé

Cancer de la prostate

Cancer de la prostate métastatique résistant à la castration

Transformer le facteur de croissance-β

Transformation épithéliale-mésenchymateuse

Diméthylsulfoxyde

Administration des aliments et des médicaments

Nitazoxanide

Kit de comptage de cellules-8

Carboxyméthylcellulose sodique

Activateur du récepteur du facteur nucléaire-κB

Phosphatase acide tartrate-résistante

Taux de fausse découverte

Stand Up to Cancer / Fondation du cancer de la prostate

Événements liés au squelette

Concentration inhibitrice demi-maximale

Densité optique

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Nous remercions les membres du personnel du Laboratory Animal Center de la Southern University of Science and Technology pour leur soutien dans les études sur les animaux.

Cette étude est soutenue par la subvention JCYJ20200109141229255 de la Commission des sciences, de la technologie et de l'innovation de la municipalité de Shenzhen.

Qingqing Huang et Mingcheng Liu ont contribué à parts égales à ce travail.

Département de biologie cellulaire humaine et de génétique, École de médecine, Université des sciences et technologies du Sud, 1088 Xueyuan Blvd, Shenzhen, 518055, Chine

Qingqing Huang, Mingcheng Liu, Duo Zhang, Bing-Biao Lin, Xing Fu, Zhiqian Zhang, Baotong Zhang et Jin-Tang Dong

Département d'urologie, Centre du rein et d'urologie, Centre des troubles du plancher pelvien, Septième hôpital affilié, Université Sun Yat-sen, Shenzhen, 518000, Chine

Bing-Biao Lin

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QH, ML et JTD ont conçu les expériences ; QH et ML ont mené la plupart des expériences et DZ a purifié les protéines KLF5 et participé aux essais d'interaction médicament-protéine ; QH a analysé les données expérimentales ; BL et XF ont effectué des analyses bioinformatiques ; QH, JTD, ML et BL ont rédigé, révisé et révisé le manuscrit ; BZ et ZZ ont participé à la conception de certaines expériences ; et JTD a conçu le projet, supervisé l'étude, fourni des conseils généraux et finalisé le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance à Jin-Tang Dong.

Toutes les souris ont été entretenues et manipulées conformément au guide des National Institutes of Health pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. Les expériences sur les animaux ont été réalisées avec l'approbation du Comité d'éthique des animaux de laboratoire de l'Université des sciences et technologies du Sud (numéro d'approbation : SUSTC-JY2019030-1).

N'est pas applicable.

Les auteurs déclarent n'avoir aucun intérêt concurrent.

Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Comparaison de la capacité de migration et d'invasion entre différentes formes de cellules exprimant KLF5, liée à la Fig. 1. Figure S2. L'effet de NTZ sur l'invasion des cellules KLF5 acétylées (KQ) et non mutées, lié à la Fig. 1. Figure S3. L'effet de NTZ sur la prolifération cellulaire dans les cellules exprimant le KLF5 acétylé, lié à la Fig. 1. Figure S4. NTZ n'a provoqué aucune toxicité notable in vivo, liée à la Fig. 2. Figure S5. Images BL réprésensibles de chaque souris au jour 7 (à gauche) et analyse d'intensité BL (à droite), liées à la Fig. 3. Figure S6. NTZ a régulé négativement l'expression de MMP9 induite par KLF5 acétylé. Figure S7. Gènes différentiels entre les groupes KQ-Ctrl et KR-Ctrl et analyse de la survie globale de 7 gènes différentiels, liés Fig. 5 et Fig. 6. Figure S8. Le nitazoxanide réduit la production de MYBL2 induite par le KLF5 acétylé, liée à la Fig. 7. Figure S9. Am80 en tant que contrôle négatif ne se lie pas aux protéines KLF5, KLF5K369Q et KLF5K369R, liées à la Fig. 8.

Dépistage secondaire de 87 composés à succès. Tableau S2. Troisième dépistage de drogue de 25 composés à succès. Tableau S3. Gènes différentiels affectés par NTZ dans RNA-Seq. Tableau S4. TPM de cellules PC-3 avec KR et KQ en présence ou en l'absence de NTZ dans l'ARN-Seq. Tableau S5. L'importance de la survie globale des gènes régulés négativement par NTZ ou des gènes régulés positivement par NTZ dans la base de données SU2C.

Les images d'immunoblot ou de gels non recadrées.

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Réimpressions et autorisations

Huang, Q., Liu, M., Zhang, D. et al. Le nitazoxanide inhibe les métastases osseuses induites par le KLF5 acétylé en modulant la fonction du KLF5 dans le cancer de la prostate. BMC Med 21, 68 (2023). https://doi.org/10.1186/s12916-023-02763-4

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Reçu : 26 octobre 2022

Accepté : 30 janvier 2023

Publié: 21 février 2023

DOI : https://doi.org/10.1186/s12916-023-02763-4

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